柴胡和白芍醋炙前后組方對四逆散中5 種成分的影響

莫子晴 蔡 皓 *段 煜裴 科劉 靜張雅婷鈕敏潔

(1.南京中醫藥大學藥學院,江蘇 南京 210023;2.南京中醫藥大學國家教育部中藥炮制規范化及標準化工程研究中心,江蘇 南京 210023;3.山西中醫藥大學制藥與食品工程學院,山西 太原 030024)

四逆散最早記載于張仲景所著《傷寒論》,由柴胡、白芍、枳實、炙甘草四味藥組成,具有疏肝解郁、和解表里之功效,為調節情志作用的經典名方,也是中醫臨床治療抑郁的基礎方。醋是中藥炮制的一種重要輔料,具有引藥入經、破血快、散瘀消腫的作用,被廣泛應用于疏肝解郁、散瘀止痛藥物的炮制。《本草蒙筌》 有“用醋注肝經,且資住痛” 的記載。柴胡與白芍醋炙后,均能增強其疏肝解郁的作用[1-2]。作為君藥和臣藥,兩者炮制后也顯著提高了復方抗抑郁作用的效果[1]。然而,炮制后對復方產生功效及成分的具體影響目前仍然缺乏全面的數據證明。

為了揭示炮制對復方增效的科學內涵,實驗室前期采用UHPLC-Q-TOF/MS 技術對柴胡和白芍醋炙前后組方的四逆散化學成分進行比較,并結合多元數據分析手段篩選出12 種成分為柴胡和白芍醋炙后組方四逆散增效的潛在物質基礎,包括柴胡皂苷B2等重要成分。柴胡皂苷是柴胡發揮抗抑郁作用的主要成分[3-4],而柴胡皂苷D 為藥理活性最高的單體之一[5]。芍藥苷可以改善利血平致抑郁模型小鼠腦組織5-HT 和NE 的含有量[6],且對皮質酮和谷氨酸誘導的PC12 細胞具有保護作用[7]。甘草苷是炙甘草的重要活性成分,具有抗氧化、抗癌、抗抑郁等作用[8-10]。另有研究表明,橙皮素具有抗氧化、抗炎、保護心血管及抗腫瘤的藥效作用,是枳實的主要有效成分[11-13]。本研究采用雙波長HPLC 法探究柴胡和白芍醋炙前后組方對經方四逆散中5 種成分含有量的影響,以期從物質基礎的角度闡釋中藥炮制及配伍組方的科學內涵。

1 材料

1.1 儀器 E2695 高效液相色譜儀、Empower 色譜工作站、2998 紫外檢測器(美國Waters 公司)；KQ-500E 型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；BSA224S-CW 天平(萬分之一,德國Sartorius 公司)；Quintix35-1CN 天平(十萬分之一,德國Sartorius 公司)。

1.2 試劑與藥物 柴胡皂苷D(批號C026181218)、柴胡皂苷B2(批號C051181206)、芍藥苷(批號S010180416)、甘草苷(批號G009181216)、橙皮素(批號C017181129) 對照品均購自成都瑞芬思生物科技有限公司(純度均大于98%)。柴胡(批號20180601)、白芍(批號20180611)、枳實(批號20190129)、炙甘草(批號20180713) 飲片均購自銅陵禾田中藥飲片有限公司,經南京中醫藥大學藥學院中藥鑒定教研室劉訓紅教授鑒定為正品。

2 方法與結果

2.1 色譜條件 Kromasil C18色譜柱(4.4 mm ×250 mm,5 μm)；流動相乙腈(A) -水(B),梯度洗脫(0～10 min,15% A；10～25 min,15%～22%A；25～35 min,22%～40% A；35～50 min,40%～45.1% A；50～70 min,45.1%～51.2% A；70～97 min,51.2%～95%A；97～100 min,5%A)；體積流量1 mL/min；柱溫40 ℃；檢測波長210 nm(柴胡皂苷D),240 nm (柴胡皂苷B2、芍藥苷、甘草苷、橙皮素)；進樣量20 μL。色譜圖見圖1。

2.2 混合對照品溶液制備 精密稱取柴胡皂苷D、柴胡皂苷B2、芍藥苷、甘草苷、橙皮素對照品適量,置同一5 mL 量瓶中,加甲醇溶解并定容至刻度,搖勻,配制成質量濃度分別為1.334 mg/mL(柴胡皂苷D)、0.828 mg/mL (柴胡皂苷B2)、1.088 mg/mL (芍藥苷)、1.206 mg/mL (甘草苷)、1.124 mg/mL (橙皮素) 的溶液,即得,置4 ℃冰箱保存。

2.3 供試品溶液制備 精密稱取柴胡、白芍、枳實、炙甘草各0.2 g,加入20 mL 70%甲醇,稱定質量,超聲(1 200 W,40 kHz) 處理45 min,靜置,70%甲醇補足減失質量,搖勻,濾過,濾液經0.22 μm 微孔濾膜過濾,取續濾液,即得四逆散供試品溶液[14]；精密稱取醋柴胡、醋白芍、枳實、炙甘草各0.2 g,同法制得醋炙品組方四逆散供試品溶液。

圖1 各成分HPLC 色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents

2.4 專屬性試驗 取各樣品,在“2.1” 項色譜條件下進樣,發現芍藥苷、甘草苷、橙皮素、柴胡皂苷B2、柴胡皂苷D 的保留時間分別為16.85、20.03、39.83、45.03、58.38 min,其他成分對測定無干擾,見圖1。

2.5 重復性試驗 精密稱取同一批飲片,按“2.3” 項下方法制備供試品溶液各6 份,在“2.1” 項色譜條件下進樣,測得四逆散中柴胡皂苷D、芍藥苷、甘草苷、橙皮素含有量RSD 分別為2.75%、2.38%、1.79%、2.93%,醋炙品組方四逆散(含醋柴胡及醋白芍) 中分別為2.74%、2.58%、1.13%、1.54%、2.16%,表明該方法重復性良好。

2.6 精密度試驗 分別精密吸取柴胡皂苷D、柴胡皂苷B2、芍藥苷、甘草苷、橙皮素的低、中、高質量濃度對照品溶液,在“2.1” 項色譜條件下連續進樣3 次,記錄峰面積,測得柴胡皂苷D RSD分別為2.99%、2.02%、1.94%,柴胡皂苷B2RSD分別為1.64%、1.55%、2.04%,芍藥苷RSD 分別為1.13%、0.22%、0.43%,甘草苷RSD 分別為2.04%、0.36%、0.36%,橙皮素 RSD 分別為2.75%、0.52%、0.31%,表明儀器精密度良好。

2.7 線性關系考察 精密吸取各對照品母液適量,甲醇稀釋成6 個質量濃度,進樣量20 μL。以對照品質量濃度為橫坐標(X),峰面積積分值為縱坐標(Y) 進行回歸,結果見表1,可知各成分在各自范圍內線性關系良好。

2.8 加樣回收率試驗 取已測含有量的同一批飲片組方四逆散 (含0.05 g 柴胡、0.05 g 白芍、0.05 g 炙甘草、0.05 g 枳實) 及同一批飲片醋炙品組方四逆散(含0.05 g 醋柴胡、0.05 g 醋白芍、0.05 g 炙甘草、0.05 g 枳實) 各6 份,精密加入柴胡皂苷D、芍藥苷、甘草苷對照品溶液適量,按“2.3” 項下方法制備供試品溶液,在“2.1” 項色譜條件下進樣,計算回收率。結果見表2。

取已測含有量的同一批飲片組方四逆散(含0.2 g 柴胡、0.2 g 白芍、0.2 g 炙甘草、0.2 g 枳實) 及同一批飲片醋炙品組方四逆散(含0.2 g 醋柴胡、0.2 g 醋白芍、0.2 g炙甘草、0.2 g 枳實)各6 份,精密加入柴胡皂苷B2、橙皮素對照品溶液適量,按“2.3” 項下方法制備供試品溶液,在“2.1” 項色譜條件下進樣,計算回收率及RSD。結果見表3。

表2 四逆散中各成分加樣回收率試驗結果（n=6）Tab.2 Results of recovery tests for various constituents in Sinisan （n=6）

2.9 穩定性試驗 按“2.3” 項下方法制備供試品溶液,室溫下放置,于0、4、8、12、24 h 在“2.1” 項色譜條件下進樣,測得四逆散供試品溶液中柴胡皂苷D、芍藥苷、甘草苷、橙皮素的峰面積RSD 分別為2.81%、2.41%、2.38%、1.63%,醋炙品組方四逆散供試品溶液中分別為2.80%、2.41%、1.14%、1.39%、1.00%,表明溶液在24 h 內穩定性良好。

2.10 樣品含有量測定 按“2.3” 項下方法制備6 批供試品溶液,在“2.1” 項色譜條件下進樣,計算含有量,結果見表4。

3 討論

一般而言,在單味藥中,柴胡經醋炙后,Ⅰ型皂苷(柴胡皂苷A、柴胡皂苷D) 的含有量會顯著下降,而Ⅱ型皂苷(柴胡皂苷B2) 的含有量會明顯上升[15-18]。但根據反復實驗驗證,在柴胡和白芍醋炙后組方的四逆散中,柴胡皂苷D 的含有量不僅沒有降低,反而呈現小幅度的升高。柴胡皂苷D 在單味藥以及在君藥和臣藥醋炙前后組方中所表現出的完全不同的變化,進一步表明四逆散中復雜的物質環境能改變同一種物質的溶出和轉化。Zhou等[1]研究表明,柴胡皂苷B2是柴胡和白芍醋炙配伍組方四逆散發揮抗抑郁作用的潛在增效物質之一。本實驗經多次驗證發現,在四逆散中,柴胡皂苷B2的響應值極低,幾乎檢測不到。而在柴胡和白芍醋炙配伍組方的四逆散中,柴胡皂苷B2的含有量有了明顯的升高,表明該推斷是合理可信的。

本實驗結果表明,柴胡皂苷B2、柴胡皂苷D的改變是醋炙品組方四逆散增強療效的重要物質基礎。而橙皮素以及甘草苷含有量的改變,進一步表明柴胡和白芍醋炙后與枳實和炙甘草一起組方四逆散,不僅影響自身活性成分的浸出,也對其他中藥有效成分的含有量有所影響,這可能是由于柴胡與白芍醋炙后組方的酸性環境改變了物質的轉化和溶出的緣故。醋炙增效以及疏肝解郁的具體機制還有待進一步深入研究。

表3 醋炙品組方四逆散中各成分加樣回收率試驗結果（n=6）Tab.3 Results of recovery tests for various constituents in Sinisan containing vinegar-processed Bupleuri Radix and Paeoniae Radix Alba （n=6）

表4 各成分含有量測定結果（mg/g，，n=6）Tab.4 Results of content determination of various constituents （mg/g，，n=6）

表4 各成分含有量測定結果（mg/g，，n=6）Tab.4 Results of content determination of various constituents （mg/g，，n=6）

注:與四逆散組比較,**P ＜0.01。