紅豆杉資源提取紫杉醇技術進展

韓木先，祝劍峰，李 輝，王祖才，姚敏敏

（湖北生態工程職業技術學院生態環境學院，湖北武漢 430200）

紫杉醇是一種天然抗癌活性物質，被用于治療卵巢癌、乳腺癌、肺癌等，同時也在研究與其他抗癌藥物聯用的治療方法，是獲得FDA 批準的第一個來自天然植物的化學藥物[1]，其臨床應用范圍正逐步擴展[2]。

當前，只發現紫杉醇天然存在于紅豆杉屬和澳洲紅豆杉屬植物中，且它們紫杉醇含量極低，僅僅為干質量的0.005% ～0.07%，而且不同的植物種屬以及不同的植物器官含量有較大差異[3]。因為紅豆杉類植物生長特別緩慢，紫杉醇在樹皮中的含量最高，但紅豆杉樹剝了樹皮會死亡。要獲取天然紫杉醇，需要新剝取樹皮等植物組織，再提取，如從砍伐樹木、收集、分離、萃取紫杉醇，人力物力財力耗費極大，消耗森林資源，難產業化。因天然紫杉醇提取難實現產業化，從植物中提取代價太高，紫杉醇原料來源不足，尋找新的植物資源、新技術迫在眉睫。利用紅豆杉資源提取紫杉醇的技術，迄今為止已經探索出利用生物技術的離體培養法、內生菌培養法、微生物轉化法等多種方法獲得紫杉醇[1，4-5]。近年來，如何獲取紅豆杉資源和得到紫杉醇的新技術，已成為研究熱點。

1 離體培養法

離體培養，又稱植物組織培養或植物無菌培養，是利用植物離體的器官、植物組織或植物細胞以及原生質體等，通過無菌、人工培養基及適宜溫度等條件誘導出愈傷組織、不定芽、不定根，最后得到植株的技術。

離體培養法是得到紫杉醇的重要方法，也是合成前體紫杉醇來源的一重要技術，因其無污染、不破壞自然資源及不受自然條件的限制，得到迅速發展。

1.1 細胞培養法

細胞培養法指通過體外模擬體內環境，使細胞生存、生長、繁殖，該方法能維持細胞主要結構和功能[6]。

研究表明，早在 20世紀70 年代，針對歐洲紅豆杉，早有胚培養的研究。Zeldin等的研究結果顯示，大量的研究集中在紅豆杉的細胞培養上，培養的種或變種大部分已證實有紫杉醇產生[7]。美國 Christen等于1989年，已通過對太平洋紅豆杉細胞培養生產出紫衫醇[8-9]。不久以后，日本、德國和韓國等相續報道了可以通過細胞培養的技術，獲取高含量的紫杉醇。梅興國等的研究顯示，通過對比研究兩相培養系統中紅豆杉細胞的生長與代謝規律，40d培養后，紫杉醇的產量為 30.19mg/L[10]。這些研究顯示，紅豆杉懸浮細胞大規模培養生產紫杉醇，進而實現產業化，有望實現。趙晶以東北紅豆杉為原料，通過檢測技術的優化、誘導、高產細胞篩選，建立了細胞懸浮體系，并通過添加代謝調節因子提高細胞懸浮體系中的紫杉醇產量，初步構建了高效獲取紫杉醇的技術體系[11]。李純以東北紅豆杉幼莖為材料，在適宜的（補光）環境條件下，對東北紅豆杉愈傷組織誘導，然后不斷地進行繼代培養，選擇紫杉醇含量高且穩定的愈傷組織，進行高產細胞株系的篩選，并對細胞懸浮培養條件進行優化，得到一套優化工藝[12]。

由于該方法不受自然條件限制，紫杉醇產量較高等優點，是當今實現紫杉醇工業化生產最有前途的方法。

1.2 發根培養法

發根培養法是離體培養的另一方向，是通過發根土壤桿菌誘導紅豆杉細胞，得到發根，然后大量培養，再從中提取紫杉醇[6，13]。Vikas Srivastava等詳細介紹了發根培養法的應用、前景、應用案例等[14]。因為發根生長速率快、遺傳穩定，并且正常根的分化結構穩定，發根培養法很有希望成為獲取產紫杉醇的重要技術。

黃遵錫等的研究結果表明，通過發根農桿菌誘導紅豆杉芽外植體，誘導出的毛狀根，40d后轉化率達到30%。經反應檢測，毛狀根中的紫杉醇含量達到短葉紅豆杉愈傷組織的1.3～8.0倍，過程中，毛狀根也分泌了紫杉醇[15]。盛長忠等的研究表明，通過誘導愈傷組織，20d 的愈傷組織對該細菌比較敏感，當感染時間為5min時，冠癭誘導率達到15.0 %，對冠癭組織檢測顯示，有特異的胭脂堿存在并產生了紫杉醇[16]。Katarzyna Syklowska-Baranek等研究了兩種前體l-苯丙氨酸和對氨基苯甲酸對紅豆杉培養物中紫杉醇的生長和積累的影響，l-苯丙氨酸可使紫杉醇產量從40.3μg/L至568.2μg/L，而對氨基苯甲酸對紫杉烷產量的影響不太明顯，紫杉醇產量最高（221.8μg/L）[17]。

該技術前景很好：發根生長速度快，不需要植物激素，有穩定的遺傳性，且正常根的分化結構及次生代謝含量高。但當前該工藝尚未成熟，還不足以支撐紫杉醇的工業化生產[18，19]。

2 內生菌法

Stierle等人1993年的研究結果表明，可利用內生植物真菌來生產紫杉醇和相關的紫杉烷，檢測結果顯示為，產生了紫杉醇，并且是由真菌生成的。隨后，他們又分離到一株內生真菌—小孢擬盤多毛孢菌，其發酵水平又比內生植物真菌略高。該研究具有重要研究意義和潛在的商業價值，但紫杉醇含量偏低，近期難以實現商業化生產。Yong-Cheng Li等研究了紫杉醇積累過程中內生真菌與其宿主的相互作用。Zaiyou J等研究用分離出的高效生產紫杉醇的內生真菌，用于紫杉醇的生產，效果良好。

真菌法是近年來研究的熱點，但菌種的獲得、保存較困難，目前僅可得到微克級的紫杉醇，就商業化生產目標，目前的研究現狀，任重而道遠。

3 微生物轉化法

通過生物酶類的高度選擇性，將得到的紫杉醇結構類似的一些紫杉烷類化合物，轉化得到紫杉醇的半合成前體，通過簡化分離過程，提高了資源的利用率。目前，紫杉醇類似物之間基因修飾以獲得更高活性的新化合物，已經成為一個新的研究領域，已有一些以紫杉烷類化合物為底物進行生物轉化的、有意義的研究，但該技術還遠未成熟，未能達到商業化生產。

4 紫杉醇研究的展望

由于全球環境的不斷惡化及人類對健康長壽的期望，醫藥領域將消耗越來越多的紫杉醇。目前還無法從紅豆杉資源大規模生產紫杉醇，導致紫杉醇價格昂貴，許多病人無法支付其費用。如何充分利用紅豆杉資源大規模得到并利用好紫杉醇，已成為研究的重點領域。