黑曲霉YF1 菌株固體菌劑對煙嘧磺隆降解效果研究

王佳穎，鄭 宇，王振梅,2，楊冬臣，張 哲,3，張金林

（1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 植物保護(hù)學(xué)院，河北 保定 071001；2.河北興柏農(nóng)業(yè)科技有限公司，河北 石家莊050000；3.西湖大學(xué) 工學(xué)院，浙江 杭州 310024）

煙嘧磺隆（Nicosulfuron）是玉米田常用的內(nèi)吸傳導(dǎo)型除草劑［1-2］，其通過抑制植物體內(nèi)乙酰乳酸合成酶的活性來阻止支鏈氨基酸合成，進(jìn)而阻止細(xì)胞分裂使敏感植物停止生長最終導(dǎo)致死亡［3-4］。近年來，煙嘧磺隆及其復(fù)配制劑的大量使用導(dǎo)致殘留藥害問題增多，特別是敏感作物如小麥和十字花科蔬菜等更容易產(chǎn)生藥害［5］。

微生物降解是農(nóng)藥降解過程中極為重要的途徑［6-7］，已經(jīng)成為修復(fù)土壤中煙嘧磺隆殘留的重要手段［8］。趙浩宇等［9］分離出1 株硝基假單胞菌NSA02，將其接種到煙嘧磺隆處理過的土壤樣品中，煙嘧磺隆的降解率比未接種NSA02 的土壤高5 ～6倍。朱將偉等［10］從土壤中分離得到1 株短小芽孢桿菌ZHU-11，在96 h 內(nèi)對土壤中濃度為20 mg/kg的煙嘧磺隆降解率達(dá)97%，并在此基礎(chǔ)上研發(fā)了菌劑，該菌劑可以降低土壤中煙嘧磺隆的殘留。張哲等［11-12］將可降解煙嘧磺隆的枯草芽孢桿菌YB1 加工成顆粒劑，當(dāng)土壤中添加20 g/kg YB1 菌株顆粒劑，28 d 后可將土壤中濃度為1 mg/kg 的煙嘧磺隆降解至對小麥無明顯藥害水平。微生物固體菌劑還被應(yīng)用于水體凈化和誘導(dǎo)植物產(chǎn)生抗病能力等方面［13-14］。

黑曲霉是一種絲狀真菌，被廣泛應(yīng)用于生產(chǎn)有機(jī)酸［15］、加工酶制劑［16］和進(jìn)行污水處理［17］等方面。本實(shí)驗(yàn)室前期利用富集培養(yǎng)技術(shù)從農(nóng)藥廠污泥中分離得到1 株可降解煙嘧磺隆的黑曲霉YF1［11］，并對其在液體環(huán)境對煙嘧磺隆的降解條件進(jìn)行了優(yōu)化［18］。在此基礎(chǔ)上，本研究將YF1 加工為固體菌劑，并通過田間試驗(yàn)驗(yàn)證其在土壤中的實(shí)際降解效果，以期為解決環(huán)境中煙嘧磺隆殘留問題提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌種與植物 黑曲霉（Aspergillus niger） YF1 菌株，由河北農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院農(nóng)藥實(shí)驗(yàn)室保存。小麥（Triticum aestivumL.），品種為‘石新828’；白菜（Brassica pekinensisR.），品種為‘青麻葉’，供試種子均購于保定市農(nóng)資市場。

1.1.2 供試試劑及材料 煙嘧磺隆原藥（純度≥97.5%，山東京博農(nóng)化有限公司）；10%煙嘧磺隆油懸浮劑（廣東省佛山市盈輝作物科學(xué)有限公司）。固體發(fā)酵料：將麥麩與秸稈經(jīng)粉碎后過80 目篩，然后按質(zhì)量比3∶7 的比例進(jìn)行配置。供試土壤：河北農(nóng)業(yè)大學(xué)三園實(shí)踐地未使用過煙嘧磺隆的土壤，自然風(fēng)干過篩備用（孔徑3 mm）。

1.2 方法

1.2.1 YF1 菌株固體發(fā)酵條件優(yōu)化 ①固體發(fā)酵初始pH 對活菌數(shù)的影響。分別調(diào)節(jié)固體發(fā)酵料的pH值為6、6.5、7.0、7.5 和8.0，添加蛋白胨的量為5%，接種量為13%（使YF1 菌株固體培養(yǎng)基中初始孢子量為3.7×105cfu/g），含水量為150%，在培養(yǎng)箱中35 ℃培養(yǎng)7 d，試驗(yàn)重復(fù)3 次。采用血球計數(shù)板統(tǒng)計各個處理下YF1 菌株的產(chǎn)孢數(shù)，計算初始pH對YF1 菌株產(chǎn)孢量的影響，確定發(fā)酵最佳pH 值。

②固體發(fā)酵時間對活菌數(shù)的影響。根據(jù)上述結(jié)果，選擇初始pH 值為7.5 的培養(yǎng)基，按照上述方法進(jìn)行接種，分別置于35 ℃培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)72、96、120、144 和168 h，試驗(yàn)重復(fù)3 次，用血球計數(shù)板統(tǒng)計各個處理的產(chǎn)孢數(shù)，計算不同培養(yǎng)時間對YF1 菌株產(chǎn)孢量的影響，確定最佳固體發(fā)酵時間。

1.2.2 YF1 菌劑的加工及生物特性檢測 根據(jù)1.2.1試驗(yàn)結(jié)果，采用最優(yōu)發(fā)酵條件進(jìn)行YF1 固體菌劑制備。在YF1 固體發(fā)酵料中添加1%保護(hù)劑羧甲基纖維素鈉擠壓造粒，并參考農(nóng)用微生物菌劑標(biāo)準(zhǔn)對菌劑中有效活菌數(shù)、雜菌數(shù)、水分、pH 進(jìn)行測定。

1.2.3 YF1 菌劑室內(nèi)降解效果測定 ①小麥對煙嘧磺隆的敏感性測定。經(jīng)拌土處理，土壤中煙嘧磺隆的含量分別為0、0.012 5、0.025、0.05、0.1 和0.2 mg/kg。 小麥種子催芽后挑選長勢相近的進(jìn)行播種，每盆10粒，每個濃度重復(fù)3 次，置于人工氣候室培養(yǎng)，溫度（25±2）℃，濕度（69±2）%，14 d 后測量每個處理中小麥植株的根長、株高、鮮重和干重。采用SPSS 21.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計算抑制率。

②不同菌劑添加量對不同濃度煙嘧磺隆降解效果的影響。設(shè)置土壤中煙嘧磺隆濃度為0.025 mg/kg， YF1 菌 劑 添 加 量 分 別 為0、3.125、6.25、12.5 和25 g/kg；設(shè) 置 煙 嘧 磺 隆 濃 度 為0.05 mg/kg，菌 劑添加量為6.25 和12.5 g/kg；設(shè)置煙嘧磺隆濃度為 0.1 mg/kg，菌劑添加量為12.5 和25 g/kg。添加菌劑后所有處理置于人工氣候室中，分別在14、21、28、35 和42 d 時取土樣播種小麥，方法同上，試驗(yàn)重復(fù)3 次。14 d 后測量株高和鮮重，計算抑制率。

1.2.4 YF1 菌劑的田間降解效果測定 在河北農(nóng)業(yè)大學(xué)三園實(shí)踐地進(jìn)行小區(qū)試驗(yàn)，實(shí)踐地未施用過煙嘧磺隆除草劑。以小麥和白菜為供試植物，小區(qū)面積設(shè)置為0.36 m2，8 個處理：空白土壤小區(qū)，作為CK；噴施10%煙嘧磺隆油懸浮劑小區(qū)，終濃度分別為30、40 和50 mL/667 m2，記為CK+N1、CK+N2和CK+N3；空白土壤小區(qū)和噴施煙嘧磺隆小區(qū)同時撒施YF1 菌劑，菌劑施用量20 kg/667 m2， 記為CK+YF1、CK+N1+YF1、CK+N2+YF1和CK+N3+YF1， 每個小區(qū)重復(fù)3 次。30 d 后播種小麥和白菜，出苗后14 d 測量根長、株高和鮮重，并計算抑制率。

2 結(jié)果與分析

2.1 YF1 菌株固體發(fā)酵條件優(yōu)化

2.1.1 固體發(fā)酵初始pH 對活菌數(shù)的影響 由圖1可知，YF1 的孢子數(shù)量隨著初始pH 的增加先增加后減少，當(dāng)pH 值為7.5 時，孢子數(shù)量達(dá)到最大值為5.9×109cfu/g，顯著高于其他處理（P＜0.05），因此YF1 菌株固體發(fā)酵的最適初始pH 值為7.5。

圖1 培養(yǎng)基初始pH 對YF1 菌株產(chǎn)孢量的影響Fig.1 The effect of initial pH on the spore production of YF1 strain

2.1.2 發(fā)酵時間對活菌數(shù)的影響 由圖2 可知，YF1 的孢子數(shù)量隨著發(fā)酵時間的增加先增加后減少，當(dāng)培養(yǎng)時間為144 h 時，孢子數(shù)量達(dá)到最大值為6.3×109cfu/g，顯著高于其他處理（P＜0.05），因此YF1 菌株固體菌劑發(fā)酵的最佳時間為144 h。

圖2 不同培養(yǎng)時間對YF1 菌株產(chǎn)孢量的影響Fig.2 The effect of different cultivation time on the spore production of YF1 strain

2.2 YF1 菌株菌劑加工及生物特性檢測

依據(jù)GB-20287-2006 農(nóng)用微生物菌劑的測定方法，測定YF1 菌劑中的有效活菌數(shù)及雜菌數(shù)，結(jié)果如表1 所示，符合農(nóng)用微生物菌劑的標(biāo)準(zhǔn)。

表1 YF1 菌株菌劑生物特性檢測Table 1 The biological characteristics of YF1 strain granules

2.3 YF1 菌劑室內(nèi)降解效果

2.3.1 小麥對煙嘧磺隆敏感性的測定 由試驗(yàn)結(jié)果可知，煙嘧磺隆對小麥株高的IC25、IC50和IC75分別為0.025、0.05 和0.1 mg/kg 干土。 小麥株高和土壤中煙嘧磺隆濃度之間成線性關(guān)系，方程為Y= 2.784X+ 3.590，相關(guān)系數(shù)R2 = 0.979。小麥鮮重與土壤中煙嘧磺隆濃度之間成線性關(guān)系，方程為Y= 2.422X+ 2.024，相關(guān)系數(shù)R2 = 0.944。故選擇以小麥的株高和鮮重為后續(xù)室內(nèi)試驗(yàn)的主要測量指標(biāo)。

2.3.2 不同菌劑添加量對不同濃度煙嘧磺隆降解效果的影響 不同量YF1 菌劑對不同濃度煙嘧磺隆在小麥上產(chǎn)生的藥害均有一定緩解作用，不同濃度下主要有代表性的結(jié)果如圖3 所示，施用YF1 菌劑14、21、28、35 和42 d 后，隨著菌劑添加量的增加，各處理對小麥株高和鮮重的抑制率均顯著低于不添加菌劑組（P＜0.05）。當(dāng)土壤中煙嘧磺隆濃度為0.025 mg/kg，添加菌劑 12.5 g/kg 處理35 d 后能將煙嘧磺隆對小麥株高和鮮重的抑制率分別由33.95%和17.51%降低至0.79%和-4.7%；當(dāng)煙嘧磺隆濃度 為0.05 mg/kg 時，添 加 菌 劑12.5 g/kg 處 理35 d后能將煙嘧磺隆對小麥株高和鮮重的抑制率分別由45.23%和34.17%降低至1.55%和-13.87%；當(dāng)煙嘧磺隆濃度為0.1 mg/kg 時，添加菌劑25 g/kg 處理42 d 后能將煙嘧磺隆對小麥株高和鮮重的的抑制率由50.77%和41.16%降低至-8.47%和-10.55%。

圖3 室內(nèi)盆栽試驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計結(jié)果（抑制率 %）Fig. 3 The statistical results of indoor experiment data（inhibition rate/ %）

2.4 YF1 菌劑田間降解效果

由表2 可知，CK+YF1 處理對2 種作物的各項(xiàng)生理指標(biāo)的抑制率均為負(fù)值，即添加菌劑后對作物安全。CK+N1+YF1、CK+N2+YF1 和CK+N3+YF1處理對小麥的株高和鮮重及白菜株高的抑制率均顯著低于CK+N1、CK+N2和CK+N3處理（P＜0.05）；CK+N1+YF1 處理對小麥和白菜的根長的抑制率均顯著低于CK+N1處理。其中CK+N2+YF1 處理對白菜株高的緩解效果最明顯，可將煙嘧磺隆對白菜株高的抑制率由64.34%降低至27.66%。CK+N3+YF1處理對小麥株高的緩解效果最明顯，可將煙嘧磺隆對小麥株高的抑制率由38.39%降低至-5.45%。說明YF1 菌劑可以較好的緩解煙嘧磺隆對小麥和白菜各項(xiàng)生理指標(biāo)造成的抑制作用。

表2 田間小區(qū)試驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計結(jié)果（抑制率 %）Table 2 The statistical results of field experiment data（inhibition rate %）

3 討論與結(jié)論

不同菌株由于其生理特征不同，因此其最適培養(yǎng)條件也會出現(xiàn)差異。本實(shí)驗(yàn)中得出的YF1 固體菌劑的最佳發(fā)酵條件：初始pH 為7.5，培養(yǎng)時間為144 h。馬永強(qiáng)等［19］對具有除草活性的生防菌株GD-9 進(jìn)行固體發(fā)酵條件的優(yōu)化，篩選出最適初始pH 為7.6，最適培養(yǎng)時間為147.8 h。鄭露華等［20］對尖孢鐮刀菌LD105 進(jìn)行固體發(fā)酵條件優(yōu)化，篩選出最適初始pH 為6，最適培養(yǎng)時間為120 h。馬曉亮［21］對煙嘧磺隆降解菌粘質(zhì)沙雷氏菌N80 進(jìn)行固體發(fā)酵條件優(yōu)化，篩選出最適培養(yǎng)時間為24 h。目前尚未見到文獻(xiàn)報道煙嘧磺隆降解菌固體發(fā)酵條件中對初始pH 的優(yōu)化，因此，本試驗(yàn)研究結(jié)果可為其他降解菌固體發(fā)酵條件的優(yōu)化提供一定的參考。

本試驗(yàn)室內(nèi)盆栽試驗(yàn)結(jié)果表明，YF1 菌劑可緩解小麥所受煙嘧磺隆的藥害，隨著土壤中煙嘧磺隆濃度的增加，YF1 菌株菌劑的用量及降解時間也隨之增加，當(dāng)煙嘧磺隆的濃度為0.1 mg/kg 時，添加菌劑25 g/kg，降解時間需42 d 才能將煙嘧磺隆對小麥株高的藥害完全緩解。田間小區(qū)試驗(yàn)結(jié)果表明，YF1 菌劑均可減輕小麥和白菜所受不同濃度煙嘧磺隆的藥害，其中對小麥藥害緩解的效果更明顯，當(dāng)施藥量為40 和50 mL/667 m2時，添加菌劑后均可使煙嘧磺隆對小麥株高的藥害完全緩解。譚佳麗［22］研究表明，將腸桿菌TYM-1 接種到煙嘧磺隆濃度為1 mg/kg 的土壤中進(jìn)行室內(nèi)盆栽試驗(yàn)，28 d 后煙嘧磺隆的降解率為84%。馬曉亮等［23］研究表明，添加粘質(zhì)沙雷氏菌N80 可以促進(jìn)土壤中濃度為10 mg/kg 煙嘧磺隆的降解，30 d 后降解率為79.7%，用甜菜、小白菜和菠菜作為指示植物進(jìn)行室內(nèi)盆栽試驗(yàn)，添加降解菌N80 的處理提高了指示植物的出苗率。上述試驗(yàn)結(jié)果都是在室內(nèi)進(jìn)行的，田間實(shí)際應(yīng)用的效果還有待進(jìn)一步驗(yàn)證，所以具有一定的局限性。本研究將YF1 菌劑添加到煙嘧磺隆濃度為0.05 mg/kg的土壤中，28 d 后播種小麥進(jìn)行室內(nèi)盆栽試驗(yàn)，可將煙嘧磺隆對小麥株高的藥害降低至無明顯藥害水平，在此基礎(chǔ)上進(jìn)行了田間小區(qū)試驗(yàn)，并且具有較好的降解效果，田間試驗(yàn)設(shè)計的10%煙嘧磺隆油懸浮劑的濃度范圍為30 ～50 mL/667 m2，符合生產(chǎn)中的實(shí)際用量。

本研究將可降解煙嘧磺隆的黑曲霉YF1 加工為固體菌劑，通過敏感植物生長指示的方法來反應(yīng)施用菌劑后對煙嘧磺隆的降解效果，結(jié)果顯示YF1 菌劑在室內(nèi)和田間小區(qū)均可以緩解煙嘧磺隆對敏感植物的藥害，表明YFI 菌劑對土壤中煙嘧磺隆有較好的降解作用。前期研究報道的均為細(xì)菌菌劑應(yīng)用于土壤中煙嘧磺隆的降解［9-12,21-23］，而YF1 是真菌菌劑，本研究豐富了煙嘧磺隆降解菌劑的資源，在緩解煙嘧磺隆藥害方面具有重要研究意義。