玉米赤霉烯酮降解酶ZHD101 的表達優化及 在玉米漿脫毒中的應用

陳 偉，谷新晰，李廣靖，徐 冉，谷子林，陳寶江，盧海強

（1.河北農業大學 食品科技學院，河北 保定 071000；2. 河北農業大學 動物科技學院，河北 保定 071000）

玉米漿是濕法工藝生產玉米淀粉的主要副產品，是1 種黏稠酸性的漿體［1］。玉米漿含有大量的氨基酸、維生素和生長因子，因此在氨基酸發酵、植物蛋白調味液和飼料等領域有重要應用價值。然而玉米極易受到玉米赤霉烯酮毒素污染［2-3］，過高的玉米赤霉烯酮含量給玉米漿的應用帶來了潛在的生物安全問題。玉米赤霉烯酮( Zearalenone，ZEN)是鐮刀菌產生的次生代謝產物，具有較強的雌激素效應、致癌性和遺傳毒性［4-6］，ZEN 不僅可以降低糧食和農副產品的質量，還可以從食物鏈進入人體，并對人體健康造成嚴重損傷［7］。

大量研究者嘗試物理、化學及生物法進行玉米赤霉烯酮的降解，而其中的生物酶法具有綠色、高效及反應溫和等特點。目前已發現三類酶可有效降解玉米赤霉烯酮，分別為漆酶(Laccase，EC 1.10.3.2)，內酯水解酶(Lactonohydrolase，EC 3.1.1)和過氧化物酶(Peroxidase，EC 1.11.1.X)［8］。內酯水解酶因降解ZEN 及ZEN 衍生物的徹底性而成為研究熱點，其中ZHD101 酶因其在該類酶中的引領地位一直是研究關注的對象。2002 年，Takahashi-Ando 等首次從粉紅黏帚霉 IFO7063 中獲得ZEN 降解酶基因（ZHD101），隨后研究人員利用大腸桿菌、裂殖酵母、釀酒酵母和水稻為宿主對ZHD101基因進行異源表達及性質研究，這為全面表征酶學性質提供了豐富的數據［9-12］。隨后，ZHD101 酶的表達效率的提高及應用價值探討逐漸成為關注重點［13］。

大腸桿菌表達系統在廉價培養基中易快速生長和易于規模化生產，大量研究結果指出外源基因密碼子與表達宿主密碼子偏好性的差異會降低翻譯水平，甚至會阻斷翻譯過程。因此，通過對外源基因密碼子進行優化可提高外源蛋白的表達量。除此之外，適宜的發酵參數是提高工程菌生產能力和降低生產成本的重要手段［14-16］。目前，響應面優化策略是眾多優化方法中的首選。

本研究依據大腸桿菌的密碼子偏好性對ZHD101基因的密碼子進行同義優化，采用響應面優化策略探究工程菌最優的發酵條件，直接分析ZHD101 酶降解玉米漿中ZEN 的效果。本研究不僅可以豐富ZHD101 蛋白高效表達的策略，同時還可探究其在玉米漿ZEN 脫毒中的應用前景，為實際生產的應用提供一定指導。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

玉米漿樣品購自河北斐默特生物科技有限公司；赤霉烯酮標準品購自上海源葉生物科技有限公司；玉米赤霉烯酮(ZEN)ELISA 試劑盒，酶免；異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)，卡那霉素(Kan)等分子試劑購自北京索萊寶科技有限公司；菌株E. coliBL21(DE3)為本實驗室保存。甲醇、乙腈為色譜純，購自德國默克公司；其他試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

酶標儀，Bio-RAD；SDS-PAGE 電泳設備與凝膠成像系統，北京君意東方電泳設備有限公司。立式高速低溫離心機，HITACHI 公司；Biometra Tprofessional PCR 儀， 德 國Biometra 公 司；TU-1810 紫外分光光度計，北京普析通用儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 玉米赤霉烯酮酶ZHD101基因的密碼子優化與合成 使用數據庫(http://www.kazusa.or.jp/codon/) 中的大腸桿菌相關數據將ZHD101基因（ALI16790.1）中使用頻率低的密碼子進行優化，同時使用RNA 折疊網絡服務器和mRNA 翻譯折疊優化的密碼子以進行蛋白質二級結構預測手動校正。GC含量設定在40%至50%之間，沒有局部峰。優化后的基因由金斯瑞生物科技有限公司合成至pET-28a 表達質粒，并轉化至大腸桿菌TOP10 中保存。

1.3.2 重組菌株的構建表達及分析 將pET-28a-ZHD101 表達質粒轉化至大腸桿菌BL21（DE3）感受態細胞中，涂布于含卡那抗生素的 LB 平板上，37°C 過夜培養。挑取單克隆進行菌落PCR 鑒定，陽性克隆送上海生工生物公司測序驗證。將鑒定正確的重組子的菌株接種于含卡那抗生素的LB 液體培養基中，37 ℃振蕩培養12 h，以1%的接種量轉接于含相應抗生素的 LB 液體培養基中，37 ℃振蕩培養3 h 至A600=0.8 時，加入異丙基-β-D 硫代半乳糖苷( IPTG)至終濃度1 mmol/L，在37 ℃振蕩培養4 h。離心收集誘導表達后的細胞并使用超聲波細胞粉碎機進行破碎。高速離心后，取適量上清進行SDS-PAGE 分析。

1.3.3 工程菌株發酵條件的優化 在單因素實驗基礎上，利用Minitab 17 軟件設計Plackett-Burman 試驗對6 個影響工程菌株產酶量的因素進行分析，篩選影響表達量的最主要影響因素。Plackett-Burman設計見表1。

表1 Plackett-Burman 試驗因子與水平Table 1 Plackett Burman test factors and levels

根據Plackett-Burman 試驗結果找出的3 個最主要因素設計最陡爬坡實驗，并通過Plackett-Burman試驗回歸方程得到各因子系數，確定主要因素的變化方向及步長，得到響應面實驗的中心點。在此基礎上，運用Design Expert 11 設計Box-Benhnkens試驗對工程菌發酵產酶條件進行3 因素3 水平的響應面分析實驗，獲得最佳發酵工藝條件。

1.3.4 ZHD101蛋白表達量分析 收集取菌體沉淀，液氮凍融后向其加入100 μL 裂解液（0.5 mg/mL 溶菌酶，50 mmol/L 三羥甲基氨基甲烷—鹽酸緩沖液（Tris-HCl）pH 8.0，100 mmol/L 氯化鈉（NaCl），冰浴 45 min 后離心 15 min，取上清制樣，使用12%的聚丙烯酰胺凝膠進行SDS-PAGE（Bio-Rad），考馬斯亮藍染液對凝膠進行染色。

掃描圖像并利用Quantity One 軟件對每條電泳條帶進行圖像分析，測得電泳條帶的平均灰度值乘以相應條帶的面積（總灰度值）分析得到各樣品中目的蛋白的表達量。

1.3.5 重組酶ZHD101在玉米漿中的應用 以0.05 mol/L Tris-HCl (pH8.0) 緩 沖 液 配 制20 μg/mL ZEN 標 準品溶液。取1 mL 毒素標準品溶液，加入1 mL 酶液使ZEN 標準品溶液終濃度為10 μg/mL，37 ℃反應2 h，使用酶免玉米赤霉烯酮(ZEN)ELISA 試劑盒MM-32862O1 測定反應體系中ZEN 的含量，由ZEN 的減少量來表征ZHD101 活性。重組酶ZHD101 酶活定義：1 個酶活單位U 為每分鐘降解 1 μg ZEN 所需的酶量。

將玉米漿pH 調至8.0，在1 mL 玉米漿中加入1 mL 酶液混勻，37 ℃條件下反應1、2 和3 h，對照加入1 mL 無菌水代替酶液，進行ZEN 含量的測定。以脫毒率來評價重組酶對玉米漿中赤霉烯酮降解能力，脫毒率計算公式：脫毒率(%)=［(A1-A2) /A1］×100，其中A1為對照組玉米漿ZEN 含量，A2為酶處理組玉米漿ZEN 含量。

1.3.6 數據分析及處理 每次試驗重復測定3 次，利用 Excel 和SPSS19.0 軟件對測定結果進行統計分析，數據結果采用平均值±標準誤差表示。

2 結果與分析

2.1 ZHD101 基因的設計和密碼子優化

大量研究指出，不同物種或基因存在著同義密碼子的使用偏好性，密碼子偏好性顯著影響外源基因在表達宿主中的轉錄和翻譯速率。按照大腸桿菌密碼子偏好性替代野生基因中的部分密碼子，合成和構建ZHD101opt基因，開展重組酶的表達研究。ZHD101（ALI16 790.1）CDS 區全長為795 bp，編碼1 個264AA 組成的成熟蛋白。重新設計的目標基因ZHD101opt與野生ZHD101wt序列的一致性為 81.1%。設計后的目標基因編碼1 條長度為264 個氨基酸殘基組成的重組蛋白，與野生ZHD101一致。

在本研究中，對ZHD101wt基因密碼子、ZHD101opt基因密碼子和大腸桿菌密碼子使用頻率進行分析，結果見表2。經分析ZHD101wt基因在同義密碼子的使用偏好性上與大腸桿菌有較大差異，ZHD101wt基因序列中含有大腸桿菌稀有密碼子27 個，并且ZHD101wt基因序列中有4 處出現連續稀有密碼子（GGA CCC、CCC GGA、AGG AUA、CGA GGA）， 稀有密碼子和連續稀有密碼子的存在會降低翻譯效率，甚至使翻譯終止。ZHD101基因在優化119個密碼子后，27 個稀有密碼子被相應的同義密碼子替換，連續稀有密碼子消失。其CAI（Codon Adaptation Index）值經OptimumGeneTM 軟件在線（http://www.genscript.com.cn/ technology-support/ on-line-tools）計算為0.97；與優化前，為0.64 相比有較大改善，CAI值大于 0.8 則意味著該目標基因可以在大腸桿菌中高效表達。優化了GC含量和不利峰后，ZHD101opt基因中GC平均值由56.35%調整為60.23%，并且延長了mRNA 的半衰期，破壞了影響核糖體結合和mRNA 穩定性的莖環結構。此外，優化過程篩選并成功地修飾了順式負作用位點。

表2 ZHD101 野生型基因密碼子、ZHD101 優化型基因密碼子和大腸桿菌密碼子使用頻率統計表Table 2 Statistics of ZHD101 wild type gene codon, ZHD101 optimized gene codon and E. coli codon usage frequency

2.2 工程菌株ZHD101opt 基因誘導表達及產物的SDS-PAGE 分析

采用熱激法進行了ZHD101opt基因的大腸桿菌轉化，經測序鑒定篩選出正確的工程菌E. coliBL21 (DE3){pET-28a-ZHD101opt}進行搖瓶誘導表達后，收集菌體并裂解，取上清進行 SDS-PAGE 分析表達情況，結果見圖1，經SDS-PAGE 電泳分析得出ZHD101opt表觀分子量約為28 ～29 kD，與理論分子量28.8 kD 相符。

圖1 玉米赤霉烯酮水解酶ZHD101 的SDS-PAGE 分析Fig. 1 SDS-PAGE analysis of zearalenone hydrolase ZHD101

2.3 玉米赤霉烯酮水解酶ZHD101opt 工程菌發酵條件的優化

使 用Minitab 17 軟 件 設 計Plackett-Burman 試驗（N=6），每組進行3 次平行試驗，以工程菌表達的ZHD101 的SDS-PAGE 總灰度值為響應值。Plackett-Burman 試驗結果經分析得出誘導時間、誘導溫度和誘導種齡為顯著影響因子，進而設計最陡爬坡試驗得出響應面試驗中心點，最陡爬坡試驗實驗設計及分析結果見表3。

表3 最陡爬坡試驗及結果Table 3 Climbing test and results

由表3 可知，試驗號為3 的玉米赤霉烯酮降解酶ZHD101 表達總灰度值最大，即誘導溫度29 ℃、誘導種齡0.8 和誘導時間10 h，以此為中心點進行響應面試驗設計。運用Design-Expert 11 軟件設計3因素3 水平響應面試驗共17 個實驗點的響應面分析實驗。其中，5 個零點重復作為誤差分析，每個試驗進行3 次。響應面設計及結果見表4，回歸方程方差分析見表5。

利用 Design Expert 11 軟件，對中心組合實驗結果進行響應面回歸分析，得到工程菌的ZHD101表達量對誘導時間(A)、誘導溫度(B)和誘導種齡(C) 的多元二次回歸方程：總灰度值=-28 088 300+ 2 235 630A+9 56 535B+9 127 290C-12 651.562 52AB+183 675AC-35 316.667 41BC-95 994.416 80A2-13 675.468 75B2-6 002 300C2。

表4 響應面設計及結果Table 4 Response surface design and results

由表5 可知，本實驗的回歸模型P＜0.000 1，說明方程擬合度較好。同時，失擬項的P=0.468 0，說明失擬不顯著，殘差由隨機誤差引起，模型選擇正確；模型的決定系數R2=0.993 0，調整后調整性決定系數AdjR2=0.984 0，表明方程與實測值擬合度較高，足以反映出ZHD101的表達量與發酵條件誘導時間、誘導溫度和誘導種齡的關系，說明方程模型可信度較高。

誘導時間和誘導溫度對重組菌表達玉米赤霉烯酮水解酶ZHD101opt影響的交互作用最為顯著，Design- Expert 11 軟件預測重組菌發酵最佳條件為：誘導時間8.658 h，誘導溫度30.109 ℃，誘導種齡0.998，理論總灰度值能達8 335 575.112。在驗證預 測值時，將發酵最佳條件稍作調整為：誘導時間8.5 h， 誘導溫度30.0 ℃，誘導種齡1.0，共進行3 次平行試驗，通過SDS-PAGE 檢測，以總灰度值大小作為產酶量的比較，3 次實驗結果的總灰度值平均值為 9 334 666，是預測值的1.12 倍，結果表明模型預測是可用的。經與優化前的表達量進行對比發現， 表達量大幅度提升了約3 倍左右。

表5 回歸方程方差分析 Table 5 Analysis of variance for the regression equation

2.4 玉米赤霉烯酮水解酶ZHD101 活性的測定及在玉米漿中的應用

在玉米深加工過程中，富含水溶性蛋白質的玉米浸泡液等副產物經濃縮后為玉米漿副產物。玉米漿可以作為發酵工業的營養基源；可替代飼料中的部分蛋白質原料；還可作為植物蛋白調味液而被用在食品生產等多種領域。然而由于玉米身受玉米赤霉烯酮毒素的困擾，使得相關產品的安全性受到越來越多關注。

先以ZEN 標準品為底物測定玉米赤霉烯酮水解酶ZHD101 的活性，在37 ℃ 反應2 h 可降解（5.5±1.1）μg/mL ZEN，酶 活 為0.05 U/mL。玉米漿pH 為3.5，而pH 低于4.5 可使玉米赤霉烯酮水解酶ZHD101 不可逆失活［10］。因此進行脫毒應用時，將玉米漿的pH 調至8.0 左右。如圖3 所示，脫毒率隨著酶解時間的延長而提高，在1、2 和3 h的脫毒率分別為（6.2±1.5）%、（13.4±2.8）%和（17.1±8.0）%，其中處理1 h 和處理2 h 的脫毒率之間差異極顯著，處理1 h 和處理3 h 的脫毒率之間差異顯著，而處理2 h 和處理3 h 的脫毒率之間不存在差異。該酶對玉米漿中ZEN 的降解效果不及對ZEN 標準品的降解效果，推測很可能由于酶液濃度及玉米漿復雜的成分所致，如大量的硫酸鹽存在使得玉米赤霉烯酮水解酶ZHD101 活性受到抑制，相應后續試驗還需繼續開展。

圖3 不同酶解時間的玉米漿脫毒率Fig. 3 Detoxification rate of corn steep liquor with different enzymatic hydrolysis time

3 討論

本研究參照大腸桿菌密碼子偏好性對ZHD101酶原有堿基序列進行分析，發現ZHD101基因在同義密碼子的使用偏好性上與大腸桿菌有較大差異，ZHD101wt基因序列中含有大腸桿菌稀有密碼子27個，并且有4 處出現連續稀有密碼子，稀有密碼子和連續稀有密碼子的存在會降低翻譯效率，甚至使翻譯終止。ZHD101基因在優化后，稀有密碼子盡數被相應的同義密碼子替換，連續稀有密碼子消失，其CAI值由0.64 提高至0.97。利用宿主的密碼子偏好性對目的基因進行優化以提高異源蛋白的表達量是目前得到了人們廣泛認可的方法，但也有研究表明，對目的基因密碼子優化后，基因表達量沒有提高甚至使蛋白的含量降低［16,17］。田健等［18］利用大數據對大腸桿菌中的基因進行了統計分析發現，大腸桿菌中的高表達的基因并不是完全使用高頻密碼子進行表達，而是以1 種前段序列使用低頻密碼子，下游使用高頻密碼子，即外源基因采用高頻密碼子和低頻密碼子交錯使用的方式來實現高效表達。除此之外，基因表達效率受多種因素的影 響［19］。因此，要在分子改造策略上實現玉米赤酶烯酮ZHD101基因高效表達，后續研究中仍需要進行系統全面的分子優化措施。

重組菌發酵條件也可顯著影響重組蛋白的表達產量，如宿主外源基因的表達往往受到誘導溫度、誘導時間、誘導劑濃度、pH 值、接菌量和誘導種齡等因素的影響，并且往往是這些因素的疊加。如誘導溫度和誘導時間之間存在著交互作用，低溫誘導可以避免重組蛋白形成包涵體，誘導溫度過低則需要較長的誘導時間，而長時間的誘導可令重組蛋白降解且時間成本較高［20-22］。Garcia-Fraga 等［23］的研究發現較低的IPTG 濃度誘導可以獲得最高酶活性，而極低或極高的IPTG 誘導劑濃度可以降低酶的活性。培養基pH 值主要影響宿主大腸桿菌的生長速度，而在誘導過程中，pH 值對轉錄效率和包涵體的形成有影響［24-25］。總之，多種條件影響著重組蛋白的表達，并且某些條件之間還存在著交互作用。響應面法可以在試驗次數較低的情況下確定各獨立因子對1 個響應因子的最佳影響，并且可以解釋不同因子之間的相互作用，采用響應面方法在優化重要條件提高大腸桿菌中重組蛋白產量已取得較好效果［14-15］。本研究通過Plackett-Burman 設計對影響玉米赤霉烯酮降解酶ZHD101 產量的相關因素進行評價和篩選，發現誘導溫度、pH、接種量是影響ZHD101 表達量的3 個顯著因素，然后采用響應面分析法確定最優產酶發酵條件：誘導時間8.5 h， 誘導溫度30.0 ℃，誘導種齡1.0，表達量提高了300%。

2016 年Xiang 等［13］首 次 定 義 了ZHD101 的酶活力單位，即每分鐘降解1 μg/mL ZEN 所需要的酶量作為1 個酶活單位U。在此之前，玉米赤霉烯酮水解酶ZHD101 的酶活性是以對添加在培養基中的某一濃度的ZEN 標準品溶液的降解率來表征。同時Xiang 采用了密碼子優化、增加外源基因拷貝數和高密度發酵表達的策略，使得ZHD101 在P.pastorisGS115 中高效表達，在甲醇誘導84 h 時，發酵上清酶活性最高可達150.1 U/mL，雖然，遠遠高于本研究中的大腸桿菌ZHD101 酶的表達量，但是大腸桿菌表達系統培養條件簡單、生產時間短和培養成本低廉等特點，使得ZHD101 酶在大腸桿菌系統中進行表達依然具有強大優勢。本課題組會在后續的試驗過程中，進一步通過篩選啟動子、優化基因結構、表達質粒及宿主等方面研究提高酶的表達量。

玉米赤霉烯酮毒素是1 種影響農業經濟的主要毒素，嚴重污染谷物衍生的食品和飼料。在濕法工藝生產玉米淀粉時，大部分玉米自身毒素滯留在玉米漿中。調查研究表明，玉米及其深加工產品受ZEN 的污染較為嚴重，如2017 年，周建川等［26］調查發現玉米和玉米副產物中 ZEN 的檢出率分別為 80.25%和88. 89%。為了提高玉米相關產品的安全性，我國頒布了相應標準，如《GB 2761—2017食品中真菌毒素限量》要求谷物及其制品中玉米赤霉烯酮含量應低于60 μg/kg，《GB13078—2017飼料衛生標準》要求飼料原料的玉米漿干粉中玉米赤霉烯酮含量不得超過1 500 μg/kg［27-28］。眾多的研究只是在產酶微生物的分離及酶學性質挖掘等方面開展，而玉米赤霉烯酮降解酶表達量及應用研究相對不足。Xiang 等［13］在麥芽汁的ZEN 脫毒研究中50 μL 的ZHD101 降解酶，用12 min 可將ZEN濃度為20 μg/mL 的麥芽汁降解90%。Bi 等［29］將ZEN 降解酶ZENC (800 U) 添加到干酒糟、玉米副產品和玉米麩皮(25 g)中，ZEN 的濃度分別降低了70.9%、88.9% 和94.7%。本研究涉及的羧酸酯酶具有較強的pH 值和溫度適應性，最適反應 pH 值為8.0，最適反應溫度為30 ℃。酶解過程具有時間依賴性，本研究將ZEN 降解酶ZHD101（粗酶液）應用到玉米漿的ZEN 脫毒研究中，反應1、2 和 3 h 對玉米漿中的ZEN（約25 μg/mL）分別降解了（6.2±1.5）%、（13.4±2.8）%和（17.1±8.0）%，這一應用效果不及Xiang 等在麥芽汁應用效果，可能是玉米漿富含多種物質，如氨基酸、礦物質（微量元素）、有機酸、還原糖和維生素等［30］，可能抑制ZEN 降解酶ZHD101 的活性。

本研究通過目的基因的密碼子優化和基于Plackett-Burman 設計和響應面分析法優化發酵條件的策略，以最大程度提高大腸桿菌中玉米赤霉烯酮降解酶表達量，使酶的產量提高了3 倍左右，并且該酶在玉米漿中玉米赤霉烯酮降解應用中有著巨大前景。