谷氨酰胺轉氨酶在Pichia pastoris GS115 中的表達及其發酵條件響應面法優化

于 凡，劉 雙，陳海清，王紅靜，馬 雯，石 楠，檀建新

（1. 河北農業大學 食品科技學院，河北 保定 071001；2. 河北大學 生命科學學院/河北省微生物多樣性研究與應用重點實驗室，河北 保定 071002）

谷氨酰胺轉氨酶（Transglutaminase，縮寫為TGase，EC 2.3.13）是一種重要的食品酶［1］，具有催化?；D移、脫酰胺和蛋白質分子間或分子內的賴氨酸與谷氨酰胺共價交聯的活性［2］。后者可以改變蛋白質網絡結構、增強保水能力和促進凝膠形成，提高蛋白質營養價值［3］。因此，被廣泛應用于蛋白質的修飾，從而改善蛋白質的理化性質和功能［4］，在食品、醫藥、紡織等領域具有重要的應用價值［5］。TGase 在自然界中分布廣泛，包括豚鼠肝臟、植物以及微生物［6］。微生物來源的谷氨酰胺轉氨酶又稱為MTG（Microbial transglutaminase），與動植物來源的TGase 相比，MTG 具有分子量小、Ca2+獨立性、較高的反應速率和熱穩定性以及較寬的?；w底物專一性等優點，更適合工業生產和應用［4］。同時，因為微生物生長快，產量大，效率高，所以達到工業規模的用于食品改性的商業化MTG 都是由微生物發酵生產的［7］。然而，MTG 也存在一些缺點，如天然宿主鏈霉菌的發酵培養基相對昂貴，發酵工藝復雜，增加了大規模生產的成本和復雜程度［8］。因此，異源重組表達則成為生產MTG 的一種可行的技術手段［9］。

巴斯德畢赤酵母（Pichia pastoris）表達系統已被廣泛用于外源重組蛋白質的表達，可同時生產分泌蛋白和細胞內蛋白［10］。目前，已有500 多種來自哺乳動物、植物、酵母和細菌的外源蛋白在畢赤酵母中獲得了成功表達［11］。畢赤酵母具有操作簡單、生物量和蛋白產量高的優點，并且它是甲醇營養型酵母，具有強啟動子AOX1，可嚴格調控和驅動高水平的蛋白表達，能夠進行蛋白質水解、折疊、二硫鍵形成和糖基化等翻譯后修飾。這些特點使畢赤酵母成為大規模生產重組酶的理想宿主［12］。許多在原核系統中以非活性形式表達的蛋白質在畢赤酵母中都實現了活性形式的表達［13］。

利用畢赤酵母高效表達外源蛋白的特性，本研究將含有吸水鏈霉菌TGase 基因的pPIC9K-prokex-TGase 重組分泌表達載體在畢赤酵母GS115 中表達，并通過Plackett-Burman（PB）設計和響應面法Response surface methodology（RSM）評價并優化了TGase 的發酵條件，以期為后續大規模發酵提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株及質粒 巴斯德畢赤酵母GS115 及pPIC9K 空載質粒由本實驗室保存；吸水鏈霉菌TGase 基因克隆來自本實驗室保存的吸水鏈霉菌 （Streptomyces hygroscopicus）菌株107.3，pPIC9K- pro-kex-TGase 由本實驗室前期構建保存。

1.1.2 培養基及試劑 參考Invitrogen 畢赤酵母表達手冊，配制YPD 培養基、MD 培養基、生長培養基BMGY、誘導培養基BMMY。DH5α 感受態、 Solution Ⅰ購自北京博邁德基因技術有限公司；SalⅠ等酶購自大連寶生物公司；PCR Mix、Super Marker（100-10 kb）、質粒提取試劑盒、膠回收試劑盒購自北京全式金生物技術有限公司；引物合成及測序由通用生物系統（安徽）有限公司完成。

1.1.3 儀器與設備 SPX-250B-Z 型生化培養箱，上海博迅公司； H-1850R 臺式高速冷凍離心機，長沙湘儀公司；PCR 儀德國Biometra 公司；756P 紫外可見分光光度計，上海光譜公司；Gene Pulser Xcell電穿孔儀，美國Bio-Rad 公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 重組畢赤酵母GS115 的構建 取-80 ℃保存含pPIC9K-pro-kex-TGase 重組載體的大腸桿菌甘油保藏管，按1%接種量接種于5 mL 含0.1%（v/v）氨芐抗性的LB 液體培養基中，37 ℃、200 r/min 培養過夜，收集菌體并使用質粒提取試劑盒提取質粒。用salⅠ酶切處理重組質粒pPIC9K-pro-kex-TGase使之線性化，再電轉化至GS115 感受態細胞內并整合到基因組中，利用菌落PCR 及酶活性比色法對轉化子進行篩選，獲得陽性轉化子。

1.2.2 重組GS115/pPIC9K-pro-kex-TGase 搖瓶培養基誘導表達 挑取陽性轉化子GS115/pPIC9K-prokex-TGase，活化后按1% 接種量接種于含25 mL BMGY 生長培養基的250 mL 三角瓶中，30 ℃、200 r/min 培養25 h。參照畢赤酵母表達手冊方法，4 ℃、5 000 r/min 收集菌體并轉接到BMMY 誘導培養基中，23 ℃、200 r/min 繼續培養72 h，每24 h補加100%甲醇至終濃度0.5%。取誘導結束后的發酵液，12 000 r/min 離心10 min 收集上清液，即為粗酶液。

1.2.3 酶活測定及十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳 酶活測定使用經典氧肟酸比色法［14］，取50 μL 粗酶液置于1.5 mL 離心管中，加入50 μL A 液（CBZ、 鹽 酸 羥 胺、GSH、0.2 mol/L Tris-HAc）混和均勻，放入37 ℃水浴鍋溫浴10 min，加 50 μL B 液（3 mol/L HCL、5% FeCl3、CCL3COOH）終止反應并顯色。反應體系經12 000 r/min 離心1 min 后，取100 μL 轉入96 孔酶標板中，在525 nm 波長下測定上清液的吸光值；另取50 μL 粗酶液煮沸滅活，其余步驟同上，作為對照用于樣品測定吸光度值時調零。dispase Ⅱ處理粗酶液在37 ℃水浴鍋溫浴20 min［15］。

根據L- 谷氨酸-γ- 單羥肟酸標準曲線，y= 0.031 8x+0.042 4（x為L- 谷 氨 酸-γ- 單 羥 肟 酸 濃 度mmol/L，y為OD525下的吸光值A，R2=0.999 8）， 計算酶活力值。酶活單位定義為37 ℃下每分鐘催化形成1 μmol 的L-谷氨酸-γ-單羥肟酸所需要的酶量。使用12%分離膠對酶提取液進行SDS-PAGE 凝膠電泳分析［16］。

1.3 數據統計分析

數據統計分析旨在尋找顯著變量及其與實驗結果的關系，以便對變量水平進行管理以獲得期望的結果輸出［17］。因此根據TGase 酶活力的實驗結果，分析了TGase 酶活力和誘導表達發酵參數的關系，通過Design-Expert V8.0.6 專業實驗設計軟件，設計實驗方案、進行分析和預測。

1.3.1 Plackett-Burman（PB）設計 PB 設計［18］可 以快速、有效的從本試驗的多個發酵條件中篩選出主要因素。根據前期單因素預實驗結果，采用PB設計對接種密度、溫度、初始pH、甲醇濃度、誘導時間共5 個因素對TGase 生產的影響進行研究，試驗次數N=12，每個因素選取高低兩個水平（表1）。

表1 PB 設計的因素和水平Table 1 Factors and levels of PB design

1.3.2 Box-Behnken 設計（BBD）和響應面方法（RSM）在PB 設計結果的基礎上，通過RSM 進一步優化具有顯著影響的因素。通過Box-Behnken 設計3 因素2 水平的響應面試驗，再以粗酶液的酶活為響應值。使用二次多項式模型來探索顯著因素變量和響應變量之間的關系。最終目標是通過建模和分析影響響應值的多個獨立變量來優化發酵參數［19］。數學模型如下：

Y是預測響應值，α0為常數項，αi為因子影響系數，αij為因子間交互響應系數，αii為二階影響系數因子。XiXj自變量的水平。

2 結果與分析

2.1 重組畢赤酵母GS115/pPIC9K-pro-kex-TGase 誘導表達及SDS-PAGE 分析

將構建并篩選出的陽性轉化子菌株進行誘導表達后收集粗酶液進行酶活檢測，粗酶液可直接檢測出較低的酶活性，說明粗酶液中含有正確折疊且有活性的成熟酶TGase（mTGase），推測可能是由于GS115 菌株自身的kex2 酶識別Lys-Arg 位點并對酶原pro-kex-TGase 酶切形成了mTGase 所致。粗酶液經dispase Ⅱ處理后酶活力達到（0.314±0.002）U/mL， 而GS115 空白菌株、GS115/pPIC9K 空載菌株在相同條件下發酵上清液中沒有檢測到MTG 酶活，說明兩者不表達TGase，而含有酶原pro-kex-TGase基因的陽性轉化子菌株能夠很好地表達酶原且具有TGase 活性。

對收集的粗酶液進行SDS-PAGE 電泳分析，結果見（圖1）。泳道1、2 分別是GS115、GS115/pPIC9K 發酵上清液，未見蛋白條帶，說明GS115、GS115/pPIC9K 本身不表達TGase 酶蛋白；泳道3為GS115/pPIC9K-pro-kex-TGase 發酵上清液，在約45 kD 處出現明顯蛋白條帶，這與S. hygroscopicus谷氨酰胺轉氨酶酶原的蛋白分子理論大小基本一致，說明TGase 獲得了很好地表達且不存在糖基化修飾。然而，在胞外粗酶液中直接檢測到了TGase 酶活力，說明該表達系統也直接生成了分泌到胞外的折疊正確的mTGase，理論上其分子大小約為38 kD，但在SDS-PAGE 圖中只有1 條45 kD 的TGase 酶原條帶（圖1），說明可能只有很少的酶原經過kex2 酶活化成mTGase，故在SDS-PAGE 膠圖中未出現相應條帶。

圖1 TGase 粗酶液的SDS-PAGE 電泳分析Fig. 1 SDS-PAGE electrophoresis analysis of TGase crude enzyme solution

2.2 用PB 設計篩選TGase 表達的主要因素

所有試驗除研究因素外其它條件均保持一致，PB 實驗設計與結果見表2。

表2 PB 實驗設計與結果Table 2 PB experimental design and results

確定顯著性因素并進行方差分析（見表3）?！癙rob ＞F”（P值）值表明模型和因子的顯著性水平。“Prob＞F”值小于0.050 0 表示顯著，大于0.100 0表示不重要。PB 結果分析5 個因素對TGase 的生產影響，按重要性排序為：X3＞X4＞X1＞X2＞X5。其中X3、X4 對TGase 酶活力有顯著影響（P＜0.01），選擇X3、X4 和X1（誘導pH、甲醇濃度、接種密度）進一步優化。

表3 PB 設計結果分析Table 3 Analysis of PB design results

2.3 用RSM 優化顯著因子

2.3.1 RSM 試驗設計 使用響應面中的BBD 法對顯著因子編碼，誘導起始pH（A）、甲醇濃度（B）和誘導起始接種密度（C）進行優化試驗，研究3 個因子的相互作用和最佳水平。獲得多元二次方程如下所示：

Y為預測TGase 酶活力，A、B 和C 分別為3 個顯著因子的編碼值。每個因子有3個編碼水平（1，0，-1），共進行了17 次運行。響應面試驗設計見表4。

表4 響應面試驗設計Table 4 Experimental design of response surface

2.3.2 回歸分析 對該方程2.3.1（2）進行回歸系數顯著性檢測和方差分析。

表5 結果表明，模型F值為61.69 意味著該模型具有顯著性，只有0.01%的可能性，因為噪音而產生較大的“F值”?！癙值”即小于0.050 0 表示模型項是有效的，在這種情況下，A、B、C、A2、B2、C2是重要的因子項。大于0.100 0 的值表示因子項不重要，AB、AC、BC 不重要。失擬項為2.16.意味著缺乏擬合相對于純誤差不顯著，有23.55%的可能性出現這樣大的失擬值是由于噪聲。對可信度進行分析，模型R2=0.987 5，變異系數（C.V. %）為4.3，說明模型的擬合程度和可信度較高?！癆deq Precision”測量信噪比，比率大于4 是所期望的。該模型25.987 的比率表明信號充足。說明此模型可用于模擬TGase 酶活力的理論預測。

表5 響應面二次模型的方差分析Table 5 ANOVA of the quadratic model of response surface

2.3.3 響應面各因子相互作用的關系 為了更好地理解各因子對TGase 生產的影響，使用Design-Expert.V8.0.6 獲得了各因子的2D 等高線圖和3D 響應曲面（見圖2 ～4）。通過響應曲面和等高線圖直觀地觀察到AB，AC 和BC 之間相互作用。等高線圖呈橢圓時，表示兩因子間具有顯著的交互作用，其它則不顯著。圖2（b）圖4（b）的曲面較陡，說明pH 和甲醇濃度、甲醇濃度和接種密度的交互作用對酶活性影響較顯著。圖3（b）曲面較平緩，說明pH 和接種密度的交互作用對酶活性影響不顯著。圖2（a）圖4（a）的等高線趨向橢圓形，說明pH和甲醇濃度、甲醇濃度和接種密度的交互作用明顯。通過沿輪廓的長軸和短軸移動來獲得變量的統計最優值。在等高線圖中最小的橢圓中得到最高的預測值。預測最佳發酵條件：誘導初始pH 7，甲醇濃度2.07%，接種密度OD6006.27，預測響應值為1 U/mL。

圖2 誘導pH 值和甲醇濃度影響酶活力的等高線a 和響應面曲圖bFig. 2 The contour a and response surface plot b of induced pH and methanol concentration affecting enzyme activity

圖3 誘導pH 值和接種密度影響酶活力的等高線a 和響應曲面bFig. 3 The contour a and response surface b of induced pH density affecting enzyme activity

圖4 甲醇濃度和接種密度影響酶活力的等高線a 和響應曲面bFig. 4 Contour a and response surface b of methanol concentration and inoculation density affecting enzyme activity

2.3.4 發酵條件的優化驗證 經響應面優化，結合實際情況調整最佳誘導條件為誘導接種密度OD600為6，pH 為7，甲醇濃度為2.0%，溫度23 ℃，誘導時間72 h，進行3 組平行發酵試驗，在此條件下獲得的粗酶液經dispase Ⅱ處理，檢測到TGase 酶活力為（1.03±0.075 ）U/mL；與響應面優化設計所得預測值相近，證明該模型較好的預測了試驗結果。

3 討論與結論

到目前為止，人們嘗試了不同來源的TGase 在P.pastoris中的表達，但酶活力普遍不高，例如2019 年，Yang 等［20］試驗表明，表達弗氏鏈霉菌TGase 酶活力達到0.7 U/mL，且證明TGase 活性能夠引起于豬肉、雞肉和大豆蛋白的交聯重構。2019 年Li 等［13］研究表明，表達玉米TGase 獲得可溶性TGase 酶活力達到0.889 U/mg。而來源于S. hygroscopicus的TGase 的在酵母中異源表達研究較少，萬丹研究報道的重組吸水鏈霉菌TGase 在解脂耶氏酵母中表達酶活力為1.06 U/mL［15］。P. pastoris作為應用最廣泛的真核表達系統，對MTG 的大量表達還有巨大的發展潛力。本研究構建的重組吸水鏈霉菌TGase的P. pastoris表達系統，既可以產生大量酶原蛋白，又可以直接產生具有酶活性的mTGase，其原因可能是GS115 菌株自身的kex2 蛋白酶識別KR 位點并酶切了表達的TGase 酶原形成了有活性的mTGase，這在一定程度上實現了本研究的設計目標。Bader et al［21］研究發現，畢赤酵母可產生kex2 蛋白酶，該酶的存在為mTGase 形成提供了可能性。但在發酵條件優化前后，SDS-PAGE 電泳中均未出現明顯的mTGase 蛋白條帶，說明優化前后被kex2 酶活化的TGase 酶原仍然只是一小部分，還有很大的改造潛力。目前關于提高畢赤酵母TGase 表達量的方法，報道較多是啟動子改造、信號肽替換、高拷貝菌株篩選等［22］，該重組表達系統未來可以通過共表達kex2 酶、使用專一性切割TGase 酶原區的TAMEP蛋白酶、發酵培養基優化等方法來獲得更高的酶活力，有助于其工業化應用。

本 研 究 經 過Plackett-Burman（PB） 和Box-Behnken（RSM）試驗設計優化發酵條件，結果表明優化后獲得的TGase 酶活力比未優化發酵條件前提高了近3.6 倍，說明將PB 設計和RSM 試驗方法相結合，用于篩選顯著影響因子并揭示因子間的相互關系的優化方法可行，Yu et al［19］曾使用該方法優化生產胞外溶菌酶的發酵條件，使該酶得到了高效表達。

本研究構建了表達吸水鏈霉菌TGase 的重組畢赤酵母菌株GS115/pPIC9K-pro-kex-TGase，在接種密度OD600為6，pH 為7，甲醇誘導濃度為2.0%，溫度23 ℃，誘導時間72 h 的優化條件下，TGase 最大酶活力達到1.1 U/mL，并實現了有活性mTGase 的胞外分泌表達，為MTG 生產和分子改造提供了新思路。