雞內源性白血病毒ev21 與其側翼區 SNP 位點的連鎖關系

葛琳涵，白少川，李雪梅，趙麗杰，喬 寧，李蘭會,3

（1.河北農業大學 動物科技學院，河北 保定 071001；2.華裕農業科技有限公司，河北 邯鄲 056000； 3.河北省牛羊胚胎工程技術研究中心，河北 保定 071001）

禽白血病病毒（Avian leukosis viruses，ALV）屬于α 逆轉錄病毒類［1］。根據致病性和感染宿主的不同，ALV 被劃分為A-J 7 個亞群，其中的A-D和J 亞群為外源ALV，E 亞群為內源性白血病毒［1-2］，禽內源白血病毒ALVE 是第一個被發現的內源逆轉錄病毒［3］。內源逆轉錄病毒屬于逆轉座子的1 種類型，物種進化過程中由逆轉錄病毒入侵脊椎動物基因組經歷逆轉座復制克隆而形成，是病毒感染后的基因組殘骸。

內源病毒表達調控改變宿主生理，以病毒位點特異方式形成宿主-病毒間的互作，內源逆轉錄病毒對宿主的正效應產生新的適應性遺傳變異和抗感染能力，負效應導致腫瘤等疾病發生［4］。ev21是E型內源逆轉錄病毒中的1 種，前人研究發現ev21與萊航雞的慢羽表型連鎖，影響慢羽雞的特異免疫功能，導致慢羽萊航雞產蛋性能下降、死亡率升高［5］。而目前更多的研究發現，ev21并不與慢羽連鎖，并且有地方雞的慢羽品系表現出更高的生產性能以及免疫性能［6-7］。內源性逆轉錄病毒與宿主基因組進化、基因調節等密切相關。然而，內源性逆轉錄病毒的轉錄調節紊亂會導致疾病的發生，對蛋、肉雞的生長發育和生產有直接影響。因此，內源性逆轉錄病毒的活性需緊密調控，但其在宿主體內的活性調控機制尚不明確。

有研究認為，ALVE 的整合位置效應可能使其轉錄失活，1.5%的ALVE 位于基因編碼區，遠低于4.9%的隨機整合預期比例［8］，這也表明ALVE 的整合位置對其產生某種影響。本課題組已經克隆獲得ev21的完整基因組序列，發現ev21的LTR 區及其側翼區對其轉錄具有調控活性［9-10］，但家禽如何控制具有LTR 調控活性的ev21的轉錄而保持健康，這一問題的解決對揭示宿主與內源逆轉錄病毒的和諧進化以及病毒的防控具有指導意義。該研究發現Z 染色體上的C＞T 突變與ev21整合的連鎖關系，為解決該科學問題提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料

海蘭褐94 只、太行雞168 只、海蘭灰15 只和SPF 雞15 只，4 個品種共292 份血液DNA 樣品。

1.2 試劑

Easy pure 血液DNA 提取試劑盒，北京全式金生物有限公司；MobII 內切酶和DNA Marker，大連寶生物工程有限公司；2×TaqMasterMix，康為世紀生物科技有限公司；引物合成和測序由北京六合華大基因公司完成。

1.3 引物設計

利用Primer Premier 5.0 軟件設計引物，引物信息見表1。SNP 位點的篩選和基因型檢測用引物擴增區域見圖1。

表1 PCR 引物信息Table 1 Primers for PCR experiments

ev21整合位點側翼區SNP 位點篩選用引物P1s和P1a， 擴 增Z 染 色 體 上g.10681684-10682477（NC_006127.5） 的794 bp 序 列。ev21側 翼 區SNP 位點基因型RFLP 檢測用引物P2s 和P2a，其產物位于g.10681679-10682288，ev21占位區（OS）和未占位區（US）均能獲得610 bp 的擴增產物；P3s 和P3a 引物擴增的1 ～356 bp 和357 ～ 1 036 bp 分別位于ev21基因組序列的5′末端和g.10681598-10682277，只有ev21整合的OS 區獲得1 036 bp 的擴增產物。雞羽型鑒別用引物P4s 和P4a、性別鑒定P5s 和P5a、以及ev21陰陽性鑒定P6s 和P6a，及其PCR 反應體系和條件分別參考文獻［7, 9, 11］。

圖1 ev21 整合側翼區SNP 測序和酶切檢測擴增區域結構示意圖Fig.1 Schematic diagram for detection of SNP in ev21 flanking region

1.4 ev21 側翼區SNP 位點篩選的PCR 擴增

篩 查ev21整 合 位 點 側 翼 區SNP 用794 bp 序列PCR 擴增，反應體系為Mix 25 μL，正反引物各 2 μL，模板5 μL，ddH2O 16 μL，該體系為50 μL體系。反應程序：95 ℃預變性5 min，95 ℃變性30 s， 55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，35 個循環，72 ℃ 延伸7 min，最終4 ℃終止反應。PCR 產物送上海美吉生物公司進行測序。

1.5 SNP 位點基因型鑒定

1.5.1 OS 與US 共有區和OS 特異區的PCR 擴增610 bp 和1 036 bp 序列分別擴增OS 與US 共有區和OS 特異區，10 μL PCR 反應體系：Mix 5 μL，引物分別為0.5 和0.4 μL，模板分別為1 μL 和0.4 μL， ddH2O 分別為3 和3.8 μL。PCR 反應程序分別為：95 ℃預變性5 min，95 ℃變性30 s，退火溫度退火30 s，72 ℃延伸1 min，35 和32 個循環，72 ℃延伸7 min，4 ℃終止反應。

1.5.2 610 bp和1 036 bp酶切檢測 610 bp和1 036 bp 的擴增產物2.5 μL 置于100 μL 離心管，加入內切酶MboII 0.5 μL、10×L Buffer 2 μL、ddH2O15 μL， 12 000 r/min 離 心5 s 混 勻。37 ℃金 屬 浴1 h，取 8 μL 酶切產物用1 %的瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.6 SNP 位點轉錄因子預測

利 用 在 線 軟 件TRANSFAC?Professional 中的Patch1.0(http://gene- regulation.com/cgi-bin/pub/programs/patch/bin/patch.cgi)預測分析C＞T 突變可能引起的轉錄因子變化。

2 結果和分析

2.1 ev21 整合上游側翼區SNP 篩選

794 bp 序列PCR 擴增產物送華大基因測序。使用BioEdit 軟件比對分析79 個樣品的794 bp 測序峰圖，發現ev21 整合位點g.10681598 上游278 bp 處的C＞T 突變，位于雞Z 染色體的g.10681876 位點，存在3 種基因型：TT、CC 純合型和CT 雜合型（見圖2）。

圖2 794 bp 序列中C＞T 突變的測序峰圖 Fig.2 The peak map for C＞T mutation in 794 bp sequence

對C＞T 突變位點基因型進行匯總，結果見表2。海蘭褐和海蘭灰分別有10 個和7 個ev21陽性個體，SNP 位點全部為TT 基因型；15 個和7 個ev21陰性個體，全部為CC 基因型。太行雞的24 個ev21陽性個體，基因型為CT 雜合型；16 個ev21陰性個體中12 個為CC 純合基因型，4 個CT 雜合基因型。由此推測， C＞T 突變的T 等位基因可能與ev21的整合存在連鎖關系。為進一步明確ev21整合與該位點的連鎖關系，增加樣本數量，對C＞T 位點的基因型進行酶切檢測。

表2 ev21 整合與C＞T 位點的基因型關系Table 2 Relation of ev21 insertion and C＞T mutation

2.2 ev21 側翼區C＞T 位點基因型酶切檢測

2.2.1 610 bp 產 物 酶 切 檢 測 OS 和US 共 有 區610 bp 的酶切結果見圖3。當突變位點為C 等位基因的610 bp 序列，形成的TCTTC 序列被內切酶MboⅡ識 別，610 bp 序 列 被 切 割 為209 和401 bp 2 條帶，這種基因型定義為CC 純合型；C＞T 突變位點為T 等位基因時，內切酶MboⅡ不能識別TCTTT 序列，610 bp 序列不能被切割，定義為TT純 合 基 因 型；酶 切 后 為610 bp、209 bp 和401 bp 3 條帶的，定義為CT 雜合型。

圖3 610 bp 產物酶切凝膠檢測Fig.3 Gel detection of 610 bp product digestion

2.2.2 1 036 bp 產物的酶切檢測ev21陽性個體才能擴增1 036 bp 條帶，對其進行MboⅡ酶切后1 036 bp 序列保持完整序列（見圖4），得出ev21陽性個體在其整合位點OS 區上游278 bp 的C＞T位點全部為T 單倍型。

圖4 1 036 bp 產物酶切凝膠檢測Fig.4 Gel detection of endonuclease digestion for 1 036 bp sequence

2.2.3 不同品種雞羽型、性別和ev21與C＞T 位點基因型 雞的品種、性別、ev21整合性與C＞T 突變信息見表4。海蘭褐祖代和海蘭灰雞中ev21陽性的慢羽雞分別有18 和15 只，慢羽雞存在US 和OS 2 個拷貝，C＞T 位點610 bp 酶切檢測全部為TT 純合基因型，1 036 bp 酶切檢測全部為T 單倍型，說明ev21整 合 陽 性 的OS 區C＞T 位 點 為T 等 位 基因，而未占位US 區也為T 等位基因，所以海蘭系列ev21陽性種雞的C＞T 突變構成USTOST單倍型。海蘭褐商品代和太行雞的陽性慢羽雞分別有29 和90 只，610 bp 酶切全部為CT 雜合型，1 036 bp 酶切為T 單倍型，構成USCOST單倍型。另外，海蘭褐商品代和太行雞各有2 只和40 只陰性慢羽雞，其基因組的OS 區由于重組造成ev21缺失，從而使OS 區回復突變為US 區，所以慢羽ev21陰性雞存在2 個拷貝的US 區。其610 bp 酶切為CT 雜合型，1 036 bp 無擴增產物，從而形成2 個US 區，構成USCUST單倍型。

表4 雞的品種、性別、羽型和ev21 整合性與C＞T 位點基因型Table 4 Genotype of C＞T mutation in different breeds, feather types and ev21 integration of chickens

海蘭褐祖代、商品代、SPF 雞和太行快羽陰性雞分別有30、10、15 和35 只，快羽雞只存在US區或OS 區1 個拷貝，610 bp 酶切全部為CC 基因型，1 036 bp 無擴增產物，構成了USC單倍型。另外海蘭褐商品代和太行快羽陽性公雞各有5 和4 只，其610 bp 酶切全部為CT 雜合型，1 036 bp 酶切為T 單倍型，C＞T 突變形成了USC和OST2 種單倍型。

2.4 C＞T 突變引起的轉錄因子變化預測

利用在線工具TRANSFAC?Professional 分析C＞T 突變引起的轉錄因子變化，發現C 單倍型有CDC2、CDC25C、CCNA2，這3 個轉錄因子為調節細胞分化的負調控元件，在細胞的G0 和G1 期發揮抑制作用，可能對ev21轉錄表達的致細胞腫瘤毒性起到強化作用［12］。而T 單倍型型有EN、GR、PR-alpha 和AR，EN 轉錄因子發揮轉錄抑制作用，預測起到ev21的轉錄表達抑制作用；GR、PR-alpha和AR 分別為糖皮質激素受體、孕酮受體、雄激素受體轉錄因子，發揮抗應激、免疫調節等作用［13-15］。

3 討論和結論

本研究發現，快慢羽雞ev21整合位點上游 278 bp 處的C＞T 突變，在OS 和US 區構成5 種單倍型。快羽雞只包含ev21的OS 區或US 區，有2種單倍型分別為OST和USC型；慢羽雞包含OS 區和US 區2 個重復區域，有3 種單倍型，為慢羽陽性雞的USCOST單倍型，海蘭慢羽陽性種雞特異的USTOST單倍型，以及慢羽ev21陰性雞的USCUST單倍型，可能源于ev21的重組缺失，使OS 區回復突變為US 區，但C＞T 位點仍保留為T 單倍型。結果表明，ev21整合位點上游278 bp 處的C＞T 突變，ev21整合與T 等位基因連鎖。

3.1 內源性逆轉錄病毒在宿主基因組整合的非隨機性

ev21整合域的OS 區存在保守的T 等位基因，這可能與保持內源病毒在宿主機體內的穩定性有關。Boulliou 等發現US 區存在3 個多態位點，分別被HaeⅢ、Hind Ⅲ和ApaL Ⅰ內切酶識別，而這3 個多態位點在OS 區不存在多態性，與本試驗發現的MobII 酶切位點特征一致，說明OS 區序列保守性與ev21的結構穩定性或功能保守性有關。內源性病毒基因組在宿主體內的相對穩定性表明其對基因組可塑性的誘導從而增強進化適應性，與宿主間存在長期進化合作共生關系［16］。

Wallace 等利用全基因組測序數據和計算機流水線發現46 個人內源病毒位點整合多態性與鄰近標記的SNP 存在連鎖關系［17］。雖然一般認為內源逆轉錄病毒在宿主基因組的整合是隨機的，但是宿主基因組序列對其整合可能具有內在的調控機制。外源病毒傾向于整合在細胞的開放染色體，尤其是蛋白編碼基因附近，盡管內源病毒可能具有相似的生物偏好，Mason 等研究發現內源白血病毒的整合并非隨機的［18］，人工或自然選擇可能會剔除有害的內源病毒元件。本研究發現的T 等位基因與ev21整合的連鎖關系，一定程度證明了其整合的非隨機性。

3.2 C＞T突變引起的轉錄因子變化穩定ev21 的整合

對C＞T 突變引起的轉錄因子變化預測分析發現，T 單倍型下增加了EN、GR、PR-alpha 和AR轉錄因子的可能結合，EN 發揮轉錄抑制作用可能與機體細胞ev21的低轉錄表達及其低細胞毒性有關，GR、PR-alpha 和AR 的轉錄結合與宿主細胞的免疫調節、抗應激有關［19-20］，保證了ev21與雞宿主的和平共處共進化表達。C 單倍型下增加了CDC2、CDC25C、CCNA2 轉錄因子的結合，發揮細胞分化抑制作用與ev21的細胞腫瘤致毒性病變有關［21-22］，導致宿主癌變致死。ev21陽性個體的C＞T 突變位點全部為T 單倍型，推斷認為C 單倍型下的ev21具有較強的轉錄活性，對細胞造成較強的癌變致死毒性，所以C 單倍型的ev21整合個體全部致死淘汰，而只有與ev21整合連鎖的T 單倍型個體被保留繁衍。當然，其可能的機理還需試驗驗證。

OS 區上游278 bp C＞T 的T 突變型與ev21整合緊密連鎖，可能源于結合轉錄因子改變影響ev21的轉錄表達，最終使ev21感染的T 單倍型個體存活保留下來，而C 單倍型個體由于ev21的強毒性被淘汰。該研究發現為探究內源逆轉錄病毒與宿主的共進化關系提供理論參考，為加速我國無內源病毒的種禽的分子選育提供借鑒，關于C＞T 突變與ev21的轉錄表達間的調控關系有待進一步研究。