棉花谷胱甘肽硫轉移酶亞基編碼基因GhGST3 的 抗黃萎病功能研究

李 揚，馬麗梅，陳 悅，翁慧婷，李志坤

（河北農業大學 農學院，河北 保定 071001）

陸地棉是世界上耕種面積最大的棉花栽培種，生產過程中常因黃萎病發生而導致產量降低和纖維品質下降［1-2］。棉花黃萎病是由大麗輪枝菌侵染根部引起的一種土傳真菌性維管束病害，也被稱為棉花的“癌癥”。目前，生產上還沒有有效的防治藥物和耕作方法可以防治黃萎病［3-5］。實踐表明，通過選育和種植棉花抗病品種可以有效防治黃萎?。?］?？寺↑S萎病抗性基因并解析其抗性機制是培育抗病品種的基礎。課題組前期研究發現1 個谷胱甘肽硫轉移酶基因簇在棉花黃萎病抗病反應中發揮了重要作用［7］。但該基因簇中單個基因的抗病功能和分子機制需要進一步研究。

谷胱甘肽S-轉移酶（GST）是一組具有多種生理功能和各種生物體常見的胞質二聚體蛋白分子。它促進體內某些異型物質和內源性有害物質的親電子基團與谷胱甘肽的巰基結合，后者可以分解或形成水溶性物質并從體內釋放出來，近而達到解毒細胞的目的［8-9］。在植物中最早研究發現玉米GSTs在解毒除草劑過程中發揮了重要作用［10-11］。

谷胱甘肽硫轉移酶編碼基因屬于多基因家族，其功能具有多樣性。GST 可以在各種生物或非生物脅迫下誘導表達，增強植物對逆境的抵抗力，并且是抗氧化防御系統中的重要酶系統［12］。研究表明玉米中的GST-B和GST-Y基因在干旱脅迫條件下，酶活性顯著增高，證明GST 在激活植物抗逆反應中起重要作用［13］。玉米中GST 蛋白能夠催化谷胱甘肽與氯均三嗪阿特拉津結合，保護植物免受除草劑的傷害［11］。另有研究表明蘿卜中RsGST1-1基因可能通過參與信號轉導途徑或與其他基因共同參與蘿卜對不利重金屬脅迫的防御，表明GST 在植物體中具有解毒作用［14］。而超表達擬南芥中的GST 基因能夠減弱逆境對植物體內代謝活性的影響，使植物免受氧化損傷［15］。大豆根中發現，GSTs 能夠促進大豆的生物固氮作用［16］。在水稻根中，2 個GST基因Osgstu3和Osgstu4受重金屬和低氧誘導，同時也可響應鹽脅迫［17］。水稻Lambda 類GST 家族成員在植物生長和發育以及對抗不同的生物和非生物脅迫方面起著重要作用［18］。研究發現，亞洲綿中Phi 類GST 基因GaGSTF9能夠增強亞洲棉對黃萎病的抗性［19］。

項目組前期研究表明，植物中GST 基因被劃分為9 類，其中tau 類GST 基因數目最多。并發現位于陸地棉A 亞組09 染色體上的一個tau 類基因簇（Gh_A09G1508，Gh_A09G1509和Gh_A09G1510）在進化過程中經歷了正選擇效應，并在棉花黃萎病抗性反應中發揮了重要作用［7，20］。但對該基因簇中單獨基因的黃萎病抗性功能及機制還需進一步研究。本研究擬對抗病陸地棉品種ND601 中的Gh_A09G1510同源基因GhGST3（MK179292）進行克隆、黃萎病抗性及分子機制研究。

1 材料與方法

1.1 植物材料的培養

擬南芥和煙草種植于人工氣候室（溫度20 ～ 22 ℃，濕度70%～80%，光照強度5 000 Lux，光周期為16 h 光/8 h 黑暗）進行培養。

1.2 序列分析

在CottonFGD（https://cottonfgd.org/）網 站 下載G. hirsutum中Gh_A09G1510基因序列，CDS 序列及蛋白序列。利用DNAMAN 在CD-Search（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi） 網站對Gh_A09G1510 蛋白序列進行結構域預測。在GSDS（http://gsds.cbi.pku.edu.cn/）網站進行基因結構分析。利用Cotton FGD 數據庫對酵母菌陽性克隆片段進行序列比對分析。

1.3 基因克隆與原核表達分析

基于Gh_A09G1510基因序列設計ORF 克隆引物，在抗病陸地棉品種‘農大601’中克隆其同源基因GhGST3。將具有限制性位點的GhGST3基因片段連接至pEASY-T1 載體，并將測序的GhGST3與pET32a 載體定向連接，轉化大腸桿菌TOP10，進行菌落PCR 和雙重酶切。確認后，選擇陽性克隆并提取質粒以表達蛋白。轉化大腸桿菌BL21（DE3）。

在10 mL LB 液體培養基（含100 mg L 卡那霉素）中培養，在28 ℃下孵育直至OD 值為0.6 ～0.8，并通過IPTG 階梯表達進一步富集誘導1、2、3 和4 h 后，取1 mL 細菌溶液。以相同的方式，在28 ℃下誘導空質粒pET32a 作為對照。離心1 mL 細菌溶液以收集細胞，棄去上清液，重懸細胞，離心上清液以進行蛋白檢測，并繼續用包涵體裂解液懸浮沉淀。測試包涵體蛋白。將上清蛋白和包涵體蛋白在100 ℃的水浴中煮沸10 min，12%SDS-PAGE 凝膠電泳，考馬斯亮藍染色，觀察結果。

1.4 超表達載體的構建及純系篩選

將GhGST3ORF 連 接 至 pMD19-T 載 體， 將pMD19-T-GhGST3載體和35s:XX 載體分別進行雙酶切后，進行連接。將構建好的質粒35s:GhGST3轉化至農桿菌感受態GV3101 中。利用農桿菌介導法轉化野生型擬南芥。利用0.1%的Basta 進行純系的篩選，利用載體特異性引物對T1代擬南芥進行PCR 檢測，設計基因實時定量引物對純系進行表達量檢測。

1.5 大麗輪枝菌侵染與病指統計

大麗輪枝菌菌株臨西2-1 培養于PDA 瓊脂培養基（200 g/L 土豆，12.5 g/L 葡萄糖，15 g/L 瓊脂）。將菌塊接種于PDA 液體培養基中，25 ℃培養10 d。紗布過濾后，將菌液稀釋至（0.94×107～1×107）［21］， 用于接種。轉基因擬南芥和野生型擬南芥每棵植株接種10 mL 孢子懸浮液。接種等量的水作為對照。將21 d 苗齡的轉基因擬南芥和野生型擬南芥分別接種黃萎病菌，接菌25 d 時，統計病級及病指。

黃萎病病級統計及分析：總共分成5 個等級，0級：植株無發病癥狀，生長良好；1 級：25%的葉子發黃，呈現病態；2 級：25% ～50% 的葉片發黃，葉緣卷曲；3 級：超過75%的葉片枯萎發病，有少許葉片脫落；4 級：全株發病，葉片干枯脫落或整株死亡。病情指數的統計方法如下：病情指（Disease index）=［∑（發病級數×該級株數）］÷（調查總株數×4）×100

1.6 RNA 制備、cDNA 合成和實時定量PCR 分析

使用EASY Spin Plant（北京阿德萊德生物技術有限公司）的RNA 快速提取試劑盒進行RNA 提取，并使用PrimeScript? 第一鏈cDNA 合成試劑盒［Baori Doctor Biotechnology（北京）有限公司］ 進行cDNA 合成，利用7500 實時熒光定量PCR儀（ABI，美國），使用熒光定量試劑盒（US EVERBRIGHT INC 公司）進行實時定量檢測。AtTUB2為內參。

1.7 亞細胞定位載體的構建及觀察

以含有GhGST3基因的質粒為模板，進行GhGST3基因的擴增，將PCR 產物和35s:XX-GFP載體分別進行雙酶切后、進行連接。將構建好的質粒35s:GhGST3-GFP 和空載體質粒35s:XX-GFP 分別轉化至農桿菌感受態GV3101 中。利用煙草進行瞬時表達。具體步驟為：將農桿菌進行擴繁，OD600達到0.8 左右。將菌液離心，5 000 r/min、10 min、 棄除上清，用蒸餾水重懸2 ～3 次。用緩沖液（10 mmoL/L MES、100 mmoL/L AS、10 mmoL/L MgCl2）重懸細胞沉淀（菌液∶緩沖液=1∶1），室溫靜置2 ～3 h 后，用1 mL 注射器，注射到煙草背面，并進行標記。遮光培養48 h 后，使用激光共聚焦顯微鏡FV10i（Olympus，Japan）觀察GFP 表達情況。

1.8 酵母雙雜交

PCR 擴增GhGST3ORF，并將其克隆到pGBKT7 中，將得到的重組質粒轉化酵母菌株Y2HGold。檢測其自激活活性和毒性。按照Matchmaker?Gold Yeast Two-Hybrid System 操 作 手 冊 將 含 有 重 組 質粒的酵母菌株與本實驗室已構建的海島棉黃萎病菌誘導的cDNA 文庫進行雜交。將雜交菌液依次涂布于DDO（SD / -Trp / -Leu）,TDO（SD / -Trp /-Leu/ -His），QDO/X/A（SD / -Trp /-Leu/ -His / -Ade/X-a-Gal/AbA ）進行篩選。利用特異性引物對陽性酵母菌進行PCR 檢測。

1.9 KEGG 和GO 分析

對候選基因在http://kobas.cbi.pku.edu.cn/進行KEGG 和GO 分析［22］。

2 結果與分析

2.1 GhGST3 基因的克隆與生物信息學分析

本研究從抗病陸地棉品種ND601 中獲得GhGST3ORF 全長序列，NCBI 注冊號為MK179292。結果顯示GhGST3基因全長651 bp，編碼216 個氨基酸?；蚪Y構分析顯示GhGST3含有2 個外顯子和1 個內含子（圖1a）。結構域預測顯示GhGST3 蛋白含有2 個保守結構域GST_N_Tau 和GST_C_Tau （圖1b）。

圖1 GhGST3 基因序列分析Fig. 1 GhGST3 gene sequence analysis

2.2 超表達GhGST3 擬南芥黃萎病菌抗性鑒定

本研究獲得了轉GhGST3基因的擬南芥陽性植株（圖2a），對T1代陽性植株進行PCR 檢測，結果顯示GhGST3基因成功轉化到擬南芥基因組中（圖2b）。繼續篩選至T3代純系后，對其進行GhGST3基因實時定量檢測，野生型擬南芥中無表達，超表達擬南芥中GhGST3基因相對表達量達1.37（圖2c），表明該基因在擬南芥中穩定表達。黃萎病抗性分析顯示轉基因植株較野生型植株黃萎病抗性明顯（圖2d）。病指統計結果顯示轉基因植株病指是32.8，野生型植株病指是82.8（圖2e）。綜合結果表明：超表達GhGST3基因后，可以增強植株的黃萎病抗性。

圖2 超表達GhGST3 增強擬南芥對黃萎病的抗性Fig. 2 Enhanced Verticillium wilt resistance in Arabidopsis by Over-expression of GhGST3

2.3 GhGST3 基因的原核表達

為了進一步明確GhGST3基因的表達特性，GhGST3 原核表達分析顯示獲得了一條97.3 kD 的片段，預測顯示GhGST3 蛋白大小為24.6 kD，pET32a 載體為（包括6 個組氨酸，硫氧還蛋白，以 及Trx.Tag、His.Tag、S.Tag、trx-tag 和2 個his 標簽）72.7 kD。結果顯示GhGST3 能被誘導表達（圖3）。

圖3 GhGST3 原核表達電泳圖Fig. 3 The electrophoresis of the GhGST3 prokaryotic expression

2.4 GhGST3 的亞細胞定位

煙草中亞細胞定位結果表明，當GFP 表達時，熒光信號存在于細胞核、細胞質和細胞膜中。對于表達GhGST3 和GFP 融合的細胞，熒光信號存在于細胞核、細胞質和細胞膜中（圖4）。表明GhGST3分布于植物細胞膜、細胞質與細胞核中。

圖4 GhGST3 在煙草上皮細胞中的亞細胞定位Fig. 4 Subcellular localization of GhGST3 in tobacco epidermal cells

2.5 酵母雙雜交篩選與GhGST3 互作的靶標蛋白

為了進一步明確GhGST3 的黃萎病抗性機制，對pGBKT7-GhGST3重組質粒進行自激活檢測和毒性檢測，含有誘餌載體的酵母菌在SD/-Trp 和SD/-Trp/X-a-Gal 固體培養基上正常生長、不變藍。在 SD/-Trp/X-a-Gal/AbA 固體培養基上不生長（圖5a）， 證明重組質粒不存在自激活活性。將含有pGBKT7空載體的酵母菌和含有誘餌載體的酵母菌稀釋1/10和1/100 后，分別吸取100 μL 均勻的涂布于SD/-Trp 固體培養基上培養。結果顯示單克隆數量和大小趨于一致（圖5b），證明重組質粒不存在毒性。

將攜帶誘餌載體的酵母菌與本實驗室前期構建好的黃萎病菌誘導的海島棉cDNA 文庫進行雜交。雜交24 h 后，在顯微鏡下可以觀察到結合子呈現三葉形狀（圖5c），將雜交后的菌液依次涂布于DDO、TDO 和QDO/X/A 培養基進行陽性克隆的篩選。將篩選到的陽性克隆利用特異性引物進行PCR檢測（圖5d），對單一條帶的電泳產物進行回收、測序，利用Cotton-FGD 數據庫進行序列的比對，最終篩選得到11 個基因（表1）。其中4 個為轉錄因子編碼基因，分別編碼CIPK3、ABCI19、GATA9和MYB330。

圖5 酵母雙雜交篩選GhGST3 的互作蛋白Fig. 5 The interacting proteins screening of GhGST3 using yeast two-hybrid method

表1 陸地棉中11 個與GhGST3 互作的蛋白Table1 Eleven candidate proteins interacting with GhGST3 in G. hirsutum

2.6 互作蛋白的KEGG 和GO 分析

利用擬南芥數據庫進行11 個互作蛋白的KEGG和GO 分析，結果顯示GhGST3 可能通過植物的檸檬酸鹽代謝、氨基糖和核苷酸糖代謝、核糖體代謝、碳代謝以及氧化磷酸化等代謝路徑參與棉花抗黃萎病反應（表2）。

表2 GhGST3 互作蛋白KEGG 分析Table 2 The KEGG analysis of GhGST3 interaction proteins

GO 結果表明互作蛋白在植物體內大多參與代謝過程，其中參與羧酸代謝、草酸代謝的蛋白最多（表3）。

表3 GhGST3 互作蛋白GO 分析Table3 The GO analysis of GhGST3 interaction proteins

續表:

3 討論

在植物中，谷胱甘肽硫轉移酶主要通過同源二聚體或異源二聚體或單體發揮功能［23］。在結構上，GST 亞基包括N 端硫氧還蛋白折疊結構域和C 端α螺旋結構域，并且在這兩個結構域之間有1 個活性位點。N 端結構域與谷胱甘肽結合，C 端結構域與細胞質疏水性物質、親電試劑、有毒烷基化劑和某些內源性物質等結合，進而將結合的產物從體內排出，達到解毒細胞的目的［24-27］。GST 根據基因結構、氨基酸序列、免疫交叉反應性和底物的專一性等進行分類［28］。在棉花中，GST 分為9 類，包括Tau，DHAR，Ef1bγ，Lambda，MAPEG，Phi， TCHQD，Theta 和Zeta。 其 中Tau 和Phi 是 植 物特有的種類［29-30］。本研究從抗病陸地棉品種‘農大601’中克隆得到位于A 亞組09 染色體上tau cluster 中GhGST3基因。該基因全長651 bp，編碼216 個氨基酸，分子量為24.6 kD。含有2 個外顯子和1 個內含子。有兩個保守結構域GST_N_Tau 和GST_C_Tau。

已有功能研究發現沉默Phi 類GST 基因，沉默植株莖段中分離出較多的黃萎病菌，維管束細胞更長、更大，使大麗輪枝菌的菌絲更容易滲透浸入，臺盼藍染色后發現沉默植株葉片中染色面積更大、顏色更深，降低棉花植株對黃萎病的抗性［31］。尖孢鐮刀菌（Vasinfectum）感染棉根和下胚軸，并誘導同源GST 基因的表達［32］。推測棉花中GST 基因存在廣譜抗性。但這些研究對GST 基因可能參與的黃萎病抗性分子機制并未報道。此外，項目組前期研究發現陸地棉A 亞組09 號染色體上的一個tau 類cluster（Gh_A09G1508，Gh_A09G1509和Gh_A09G1510）在黃萎病抗性反應中發揮了重要作用［7,20］。但其中單基因在黃萎病抗性反應中的功能及抗病分子機制需要進一步研究。因此本研究在陸地棉抗病品種‘農大601’中克隆了Gh_A09G1510的同源基因GhGST3，構建了超表達35s:GhGST3載體，并對轉GhGST3基因擬南芥純系進行黃萎病抗性鑒定，結果顯示相比較野生型擬南芥，超表達株系顯著提高了黃萎病抗性，表明該基因在黃萎病抗性反應中發揮了重要作用。

亞細胞定位研究對于解析植物體內抗病基因產物發揮作用的位置、功能和機制研究有重要意義，研究表明牧豆樹（Prosopis juliflora）PjGSTU1 定位在葉綠體［33］。擬南芥中GST 定位結果顯示：所有GSTFs 和GST-U2，U7，U9，U11，U19 和U28的GFP-GST 融合蛋白都定位在細胞質中。GFPGSTT3L，GFP-GSTU12 完全定位于細胞核。GFPTCHQD 定 位 于 質 膜。GFP-GSTT1，GFP-GSTT2和GFP-GSTT3 定位于過氧化物酶體。這些蛋白質可以在不同的細胞器發揮功能［34］。本研究通過亞細胞定位證實GhGST3 在細胞核、細胞質和細胞膜中均有分布。

為了進一步明確GhGST3可能的抗病分子機制，本研究通過酵母雙雜交篩選到11 個與GhGST3 互作的靶蛋白，包括4 個轉錄因子，分別是CIPK3、ABCI19、GATA9 和MYB330。其中鈣調節神經磷酸酶B 樣蛋白（CBLs）代表植物鈣結合蛋白家族，通過與CBL 互作蛋白激酶（CIPKs）互作，在植物鈣信號傳導中起重要作用［35］。CBL 蛋白能夠通過調控植物的ABA 通路來提高植物抗病性，同時有證據表明CBL3 能夠調控擬南芥的應激反應［36］。在抗逆過程中，植物還通過轉錄因子調節某些功能基因的表達，這是植物應對逆境的主要機制之一。作為植物中最大的轉錄因子家族之一，MYB 轉錄因子在植物抗逆性過程中起著重要作用［37］。在擬南芥中，當擬南芥感染病原體時，AtMyb30 是HR 反應的正向調節劑，對細菌病原體感染引起的過敏性死亡的反應取決于SA 的積累，但不取決于NPR1。并且如果改變擬南芥AtMYB30的表達（過表達，T-DNA插入突變），SA 的水平和SA 相關基因的表達也會改變。這表明擬南芥AtMYB30參與了SA 合成的調節并調節細胞死亡［38］。此外，煙草的Myb1基因編碼水楊酸的下游信號復合物，并與病原相關蛋白（PR）基因的啟動子序列結合，參與PR 基因的激活和植物防御反應［39］。因此，GhGST3可能通過ABA 路徑和/或SA 路徑等參與棉花黃萎病抗性反應。

4 結論

棉花谷胱甘肽硫轉移酶家族GhGST3 蛋白在植物細胞膜、細胞質和細胞核中表達。在擬南芥中超表達GhGST3基因，使其對黃萎病的抗性增強。酵母雙雜交得到11 個可能與GhGST3 互作的蛋白，其中有4 個轉錄因子蛋白。證明GhGST3參與抗黃萎病反應，是潛在重要的抗病基因。