HPLC同時測定炎可寧片中9種成分的含量

許學麗 ，宋 迪，王洪明，聶 磊

（1. 山東大學 藥學院，山東 濟南 250012；2. 濱州市食品藥品檢驗檢測中心，山東 濱州 256600；3. 濱州市人民醫院，山東 濱州 256600）

炎可寧片為《衛生部藥品標準》中藥成方制劑第七冊收載品種，是一種臨床常用藥，由黃柏、大黃、黃芩、板藍根、黃連5味中藥組成，具有清熱瀉火，消炎止痢的功效[1]。目前不同廠家有多個質量標準，但只有部分標準規定有含量測定項，且只對其中的黃芩苷或鹽酸小檗堿有規定，不能有效控制產品質量[2-3]。筆者參考相關文獻[4-10]，采用反相高效液相色譜法（RP-HPLC），對炎可寧片中的9種有效成分鹽酸小檗堿、黃芩苷、黃芩素、蘆薈大黃素、漢黃芩素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚進行含量測定，為更好控制炎可寧片的質量提供了參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

島津LC-20AT型HPLC儀，包括紫外檢測器、自動進樣器、四元梯度泵等（日本Shimadzu公司）；KQ-300VDV 型超聲波清洗器（昆山超聲儀器公司）；BSG-12電熱恒溫水浴鍋（上海一恒）；CP225D電子分析天平（德國Sartorius公司）。

1.2 試劑試藥

炎可寧片（修正藥業，批號：170608，180404，180507，規格：0.3 g/片）；鹽酸小檗堿（批號：110713-201613，含量：86.8 %），黃芩苷（批號：110715-201619，含量：93.5 %），黃芩素（批號： 111595-201808，含量：97.9 %），蘆薈大黃素（批號：110795-201710，含量：98.3 %）、漢黃芩素（批號：111514-201605，含量：100.0 %），大黃酸（批號：110757-201607，含量：99.3 %），大黃素（批號：110756-201512，含量：98.7 %），大黃酚（批號：110796-201520，含量：99.2 %），大黃素甲醚（批號：110758-201415，含量：99.1 %）對照品均購于中國食品藥品檢定研究院；甲醇，乙腈，磷酸等試劑均為色譜純；水為超純水。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：InertSustain C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）； 流動相：甲醇（A）-乙腈-（B）-0.2 %磷酸溶液（C），梯度洗脫（洗脫程序見表 1）；流速：1.0 ml/min；檢測波長：254 nm；柱溫：30 ℃；進樣量：5 μl。

表1 梯度洗脫程序

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對照品溶液 精密稱取鹽酸小檗堿、黃芩苷、黃芩素、蘆薈大黃素、漢黃芩素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚對照品各適量，加甲醇溶解并制成上述成分質量濃度分別為41.9，81.6，24.7，2.53，4.98，1.13，2.51，6.79，2.97 μg/ml混合對照品溶液，備用。

2.2.2 供試品溶液 取本品 20片，除去糖衣，精密稱定，研細，取約0.6 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇100 ml，稱定重量，超聲處理30 min（功率300 W，頻率45 kHz），取出，放冷，再稱定重量，用甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續濾液作為供試品溶液。

2.2.3 陰性樣品溶液 按炎可寧片的處方比例，制備缺黃柏、大黃、黃芩和黃連的陰性樣品，并按2.2.2項下方法制備陰性樣品溶液。

2.3 系統適用性試驗

取2.2項下混合對照品溶液、供試品溶液和陰性樣品溶液，按2.1項下的色譜條件分別進樣，進樣量5 μl，并記錄色譜圖，見圖1。結果表明，在該色譜條件下，炎可寧片中的9個成分與其他色譜峰能達到基線分離，分離度均大于1.5，理論板數均大于10 000，且陰性樣品對9個成分的測定無干擾。

2.4 線性關系考察

取2.2.1項下的混合對照品溶液，按2.1項下色譜條件，分別進樣1，2，5，8，10 μl，并記錄峰面積。以9個成分的進樣量（x，ng）為橫坐標、峰面積（y）為縱坐標進行線性回歸，得回歸方程與線性范圍，見表2。炎可寧片中的9個成分在進樣量范圍內，r值均不小于0.9997，具有良好的線性關系。

2.5 精密度試驗

取2.2.2項下供試品溶液（批號：170608）適量，按2.1項下色譜條件連續進樣測定6次，記錄峰面積。結果，鹽酸小檗堿、黃芩苷、黃芩素、蘆薈大黃素、漢黃芩素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚峰面積的RSD分別為0.52 %，0.45 %，0.79 %，0.60 %，0.92 %，1.07 %，0.36 %，0.68 %，0.40 %（n=6），表明精密度良好。

圖 1 HPLC色譜圖

表2 回歸方程與線性范圍

2.6 穩定性試驗

取2.2.2項下供試品溶液（批號：170608），分別于室溫下放置0，3，6，9，12，24 h，按2.1項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結果，鹽酸小檗堿、黃芩苷、黃芩素、蘆薈大黃素、漢黃芩素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚峰面積的RSD分別為0.82 %，0.48 %，0.95 %，0.72 %，0.64 %，1.16 %，1.03 %，0.96 %，0.77 %（n=6），表明供試品溶液于室溫下放置24 h內穩定性良好。

2.7 重復性試驗

精密稱取同一批樣品（批號：170608）粉末適量，共6份，按2.2.2項下方法制備供試品溶液，再按2.1項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算各待測成分含量。結果，鹽酸小檗堿、黃芩苷、黃芩素、蘆薈大黃素、漢黃芩素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚的平均含量分別為6.302，13.239，4.425，0.541，0.836，0.144，0.356，1.180，0.392 mg/g，RSD值分別為 0.63 %，0.36 %，0.55 %，1.02 %，0.90 %，1.28 %，0.75 %，0.84 %，0.50 %（n=6），表明本方法重復性良好。

2.8 加樣回收率試驗

取已知含量的樣品（批號：170608）粉末約0.3 g，共6份，分別加入混合對照品溶液（鹽酸小檗堿、黃芩苷、黃芩素、蘆薈大黃素、漢黃芩素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚的質量濃度分別為1.911，4.025，1.350，0.1652，0.2550，0.04416，0.1088，0.3580，0.1202 mg/ml）1 ml，按2.2.2項下方法制備供試品溶液，再按2.1項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算加樣回收率，結果見表3。

2.9 樣品含量測定

取3批樣品各適量，按2.2.2項下方法制備供試品溶液，再按2.1項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算各待測成分含量，結果見表4。

0.3620 0.3580 0.7146 98.49 0.3546 0.3580 0.7130 100.11 0.3594 0.3580 0.7158 99.55 0.3643 0.3580 0.7189 99.05大黃素甲醚 0.1186 0.1202 0.2347 96.59 98.28 0.98 0.1180 0.1202 0.2360 98.17 0.1203 0.1202 0.2396 99.25 0.1178 0.1202 0.2365 98.75 0.1194 0.1202 0.2371 97.92 0.1210 0.1202 0.2400 99.00

表4 樣品含量測定結果/mg·g-1（n＝3）

3 討論

實驗中曾考慮采用多波長來測定炎可寧片中的9個有效成分，但經使用二極管陣列檢測器（DAD）分別對供試品溶液和混合對照品溶液中的待測成分進行掃描后發現，在254 nm波長處，9個待測成分均有較好吸收，且與其他色譜峰分離度較好，峰純度檢查結果也均能符合含量測定要求，陰性樣品對測定不存在干擾。因此最終選用單波長254 nm作為檢測波長，對HPLC儀的要求更低，且操作更簡單。

曾采用多個流動相進行預實驗，包括乙腈-0.1 %磷酸溶液，甲醇-0.1 %磷酸溶液等[2-7]，并對流動相的比例進行多次調整，進行梯度洗脫，結果炎可寧片中的9個待測成分峰與其他色譜峰的分離度不能達到要求。參考有關文獻[8]，最終流動相確定為甲醇-乙腈-0.2 %磷酸溶液，并對流動相的比例進行調整，梯度洗脫，結果9個待測成分峰與其他色譜峰的分離度均符合要求，且峰形均較好，理論板數均大于10 000。

炎可寧片供試品溶液的制備，分別采用超聲提取法和回流提取法試驗。結果表明，取炎可寧片粉末，用甲醇作為溶劑，超聲提取30 min能做到提取完全，與加熱回流提取1 h的含量結果相當。超聲提取操作更為方便簡單，因此最終采用甲醇為溶劑超聲提取的方法。

本實驗建立了同時測定炎可寧片中9個成分含量的方法，分離度、重復性好，準確度高，專屬性強，可為炎可寧片的質量控制和標準提高提供參考。