HPLC雙波長法測定米力農注射液有關物質

竇艷麗，牛 沖，康亞琪，文松松，陳 真，李 琳，徐玉文*

（1. 山東省食品藥品檢驗研究院 仿制藥研究與評價重點實驗室 山東省仿制藥一致性評價工程技術研究中心，山東 濟南 250101；2. 山東大學第二醫院藥品調劑科，山東 濟南 250033）

米力農（milrinone）為氨力農的同類藥物，作用機制與氨力農相同，屬于新型正性肌力藥物，是治療心衰的有效藥物，主要能強化心肌收縮能力，增加心排量，減輕心臟負荷，降低肺血管阻力，降低肺動脈壓，改善心臟功能。近年研究結果表明，米力農對老年慢性心臟病伴心力衰竭、高血壓心臟病伴心力衰竭、充血性心力衰竭均有較好的療效[1-5]。

米力農注射液是由米力農加乳酸制成的滅菌水溶液。米力農注射液的質量標準收載于《中國藥典》2015年版（ChP2015）二部與美國藥典42版（USP 42），歐洲藥典10.0版（EP10.0）未收載此品種。國內上市的該注射液采用葡萄糖或氯化鈉作滲透壓調節，鑒于采用葡萄糖調節滲透壓的產品在執行ChP2015二部標準時出現有關物質檢查結果不合格的現象，本文在ChP2015二部米力農注射液質量標準的基礎上采用雙波長高效液相色譜法（HPLC）檢查有關物質[6-8]，方法靈敏度高、操作簡便，適用于采用不同滲透壓調節劑的產品。

1 儀器、試藥及樣品

Waters 2695 2489高效液相色譜儀（紫外檢測器，四元泵，自動進樣器，美國Waters公司）；CP225D型十萬分之一電子天平[梅特勒-托利多儀器（上海）公司]；Millipore超純水機（美國Millipore公司）。

米力農對照品（批號：101065-201001），5-羥甲基糠醛對照品（批號：111626-201509），米力農雜質I對照品（批號：101066-201001），米力農雜質II對照品（批號：101358-201501）均購自中國食品藥品檢定研究院；甲醇（色譜純，天津科密歐）；其余試劑為分析純。

米力農注射液（用葡萄糖調節滲透壓的批號為16051，16221，14001，15105，15106；用氯化鈉調節滲透壓的批號為171001，201201，16088，17605）。

2 方法與結果

2.1 溶液的制備

2.1.1 系統適用性溶液 取米力農、5-羥甲基糠醛、雜質I與雜質II對照品各適量，用流動相制成每1 ml中約含10，20，100與100 μg混合溶液，即得。

2.1.2 對照品溶液 混合對照品儲備液：分別取5-羥甲基糠醛、米力農雜質I與雜質II對照品各適量，用流動相制成每1 ml分別含1，0.1，0.1 mg 混合溶液。

混合對照品溶液：取混合對照品儲備液適量，用流動相制成每1 ml中分別含5-羥甲基糠醛、米力農雜質I與雜質II 10，1和1 μg混合溶液，即得。

2.1.3 供試品溶液 取注射液，即得（濃度1 mg/ml）。

2.1.4 自身對照溶液 精密量取供試品溶液適量，用流動相制成每1 ml中含米力農2 μg溶液。

2.2 色譜條件

色譜柱Shiseido C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：水-甲醇-硼酸鈉緩沖液（取硼酸31 g，加水800 ml，緩緩加20 %氫氧化鈉溶液適量，充分振搖使硼酸完全溶解，用20 %氫氧化鈉溶液調節pH 7.0，加水稀釋至1000 ml，搖勻，即得。臨用新制）（725:250:25）；5-羥甲基糠醛的檢測波長為284 nm，米力農雜質I、雜質II、其他雜質的檢測波長254 nm；柱溫30 ℃；流速1.0 ml/min；進樣量20 μl。

2.3 系統適用性試驗

取系統適用性溶液、混合對照品溶液及供試品溶液，分別按2.2項下色譜條件測定。結果表明，在系統適用性溶液、混合對照品溶液及供試品溶液的284 nm的色譜圖中，5-羥甲基糠醛峰與其相鄰雜質峰的分離度符合要求；在254 nm的色譜圖中，雜質I峰與米力農峰的分離度大于4.0，見圖1～2。

2.4 專屬性試驗

精密稱取5份樣品[每份含米力農對照品25 mg，無水葡萄糖1.18 g（按處方比例）]，置入25 ml量瓶，分別加入1 mol/L氫氧化鈉溶液5 ml，振搖使溶解，室溫放置8 h，中和；加入1 mol/L鹽酸溶液5 ml，振搖使溶解，室溫放置8 h，中和；加入30 %過氧化氫溶液5 ml，振搖使溶解，室溫放置0.5 h；加水5 ml，振搖使溶解，置水浴中破壞5 h，取出放冷；加水5 ml，振搖使溶解，4500 lx光照條件下照射72 h，再加入0.236 mg（按5-羥甲基糠醛的限度值計算的加入量）5-羥甲基糠醛，用流動相定容至刻度，搖勻。取上述各溶液作為破壞性供試溶液，按2.2項下條件進行測定。結果表明，本品在酸、堿、氧化、高溫及光照條件下均有不同程度的破壞，在284 nm色譜圖中各降解產物峰均能與5-羥甲基糠醛峰達到完全分離，在254 nm色譜圖中各降解產物均能與主峰達到完全分離。色譜圖見圖3。

圖1 254 nm波長下的系統適用性色譜圖

圖2 284 nm波長下的系統適用性色譜圖

圖3 米力農專屬性色譜圖

2.5 檢測限和定量限

取對照品溶液及對照溶液，逐級稀釋，當S/N為10時，5-羥甲基糠醛、米力農雜質I、雜質II、米力農的定量限分別為5 ng/ml，0.025 μg/ml，0.05 μg/ml，1 ng/ml；當S/N為3時，5-羥甲基糠醛、米力農雜質I、雜質II、米力農的檢測限分別為2.5 ng/ml，0.01 μg/ml，0.025 μg/ml，0.3 ng/ml。

2.6 精密度試驗

取對照品溶液，按2.2項下色譜條件連續進樣6次，記錄各色譜峰峰面積。分別計算5-羥甲基糠醛、米力農雜質I、雜質II峰面積的RSD分別為0.11 %，0.64 %，0.16 %，精密度良好。

2.7 穩定性試驗

取供試品溶液，按2.2項下色譜條件分別于0，2，4，6，8，10，12 h測定，記錄各色譜峰峰面積。5-羥甲基糠醛、米力農雜質I、雜質II、其他單個最大雜質峰面積的RSD分別為0.10 %，1.1 %，1.1 %，1.2 %，供試品在12 h內穩定。

2.8 重復性試驗

取同一批樣品（批號16051）按2.1.3項下方法平行制備6份供試品溶液，按2.2項下色譜條件分別進行測定，5-羥甲基糠醛、米力農雜質I、雜質II的平均含量分別為0.0010 %，0.013 %和0.063 %，RSD分別為0.07 %，1.07 %和0.94 %。

2.9 線性關系考察

取混合對照品儲備溶液和供試品溶液適量，加流動相制成每1 ml中分別含米力農為0.2，0.5，1，2，3，5 μg，5-羥甲基糠醛1，2，5，10，20，50，100 μg，米力農雜質I及雜質II各為0.1，0.2，0.5，1，2，5，10 μg線性試驗溶液。照2.2項下色譜條件測定，記錄各色譜峰的峰面積。以濃度和相應峰面積進行線性回歸，所得結果見表1。

表1 4種成分的線性關系

2.10 回收率試驗

取對照品儲備液適量，分別用已知各雜質含量的供試品溶液制成相當于雜質對照濃度的80 %，100 %，120 %溶液各3份，按2.2項下色譜條件進行測定，記錄各成分色譜峰面積。分別計算各成分不同濃度的加樣回收率及RSD，結果見表2～4。

2.11 耐用性試驗

采用Waters 2695 2487高效液相色譜儀（紫外檢測器，四元泵，自動進樣器，美國Waters公司）、色譜柱Venusil MPC18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），按2.2項下色譜條件進行系統適用性試驗。結果表明，在254 nm波長的色譜圖中，雜質I峰與米力農峰的分離度大于4.0，在284 nm波長的色譜圖中5-羥甲基糠醛與其相鄰雜質峰的分離度符合要求。色譜圖見圖4～5。

表2 5-羥甲基糠醛試驗結果

表3 米力農雜質I試驗結果

表4 米力農雜質II試驗結果

2.12 樣品測定

按2.1項下方法制備混合對照品溶液、供試品溶液和自身對照溶液，分別進樣測定，記錄色譜圖至主成分峰保留時間的3倍。在284 nm色譜圖中5-羥甲基糠醛按外標法以峰面積計算，在254 nm色譜圖中米力農雜質I和雜質II按外標法以峰面積計算，其他雜質均以自身對照法計算。樣品測定結果見表5。

圖4 254 nm系統適用性色譜圖

圖5 284 nm系統適用性色譜圖

表5 樣品測定結果

3 討論

3.1 檢測波長的選擇

參考ChP2015二部收載的含葡萄糖注射液的檢測標準[9]，其5-羥甲基糠醛在HPLC檢測中檢測波長均為284 nm，通過紫外光譜掃描，5-羥甲基糠醛在284 nm波長處有最大吸收。最終確定5-羥甲基糠醛的檢測波長為284 nm。米力農、米力農雜質I、雜質II及其他雜質的檢測波長仍選擇254 nm。

3.2 5-羥甲基糠醛限度的確定

參考ChP2015二部收載的含葡萄糖注射液檢驗標準[9]中的5-羥甲基糠醛限度、國內生產企業的處方及按新建立的方法測定的結果，最終將5-羥甲基糠醛的限度訂為“不得過葡萄糖標示量的0.02 %”。

4 結論

本文所建立的HPLC法專屬性良好，可有效排除用葡萄糖調節滲透壓產品中5-羥甲基糠醛對有關物質測定結果的影響，同時又不影響用氯化鈉調節滲透壓產品的測定結果，為嚴格控制不同生產廠家生產的米力農注射液產品質量的控制提供依據。