陽離子化透明質酸衍生物的護發功效研究

王麗麗，祝美華，薛 松，齊 寧，牛貴清，陳建英,

（1. 山東省藥學科學院，山東 濟南 250101；2. 山東安華生物醫藥股份有限公司，山東 濱州 256600；3. 山東省皮膚與黏膜給藥工程技術研究中心，山東 濟南 250101）

透明質酸（hyalouronic acid，HA）是D-葡糖醛酸（GlcA）和N-乙酰氨基葡糖 （GlcNAc）雙糖單位通過交替的β-1, 3和β-1, 4糖苷鍵連接而成的大分子糖胺聚糖，大量存在于生物體內的多種組織（例如皮下組織、眼球、關節）中，商品透明質酸多為鈉鹽。它能攜帶自身500倍以上的水分，具有良好的吸濕性，是目前公認的最佳天然保濕因子，被廣泛應用于化妝品等領域[1-3]。HA為聚陰離子多糖，在使用于帶負電荷的毛發、皮膚的角質表面時，由于電荷排斥作用，阻礙其在毛發、皮膚表面的吸附。

本研究采用化學方法將季銨陽離子乳酸鹽基團引入透明質酸分子中，制備陽離子化透明質酸衍生物，并評價了其保濕、吸附性能，及對損傷毛發的修復效果和對頭發柔順度的改善，為其在化妝品領域中的應用提供依據。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Unity Inova 400核磁共振波譜儀（美國Varian）；C-MAG HS10型加熱磁力攪拌器（艾卡廣州儀器設備有限公司）；ZKXFB-2型真空干燥箱（上海樹立儀器儀表有限公司）；SHB-B95型循環水式多用真空泵（鄭州長城科工貿有限公司）；Agilent 8454型紫外分光光度計（美國安捷倫公司）；AE200型電子分析天平（瑞士Mettler Toledo公司）；JJ-1增力電動攪拌器（江辦金壇醫療儀器廠）；320型pH計（瑞士Mettler Toledo公司）；Supra55電子掃描電鏡（德國 Zeiss公司）；Unity Inova 400核磁共振波譜儀（美國瓦里安公司）；XJ801型頭發梳理儀（上海湘杰儀器儀表科技有限公司）。

1.2 材料

HA（山東安華生物醫藥股份有限公司，化妝品級）； 2, 3-環氧丙基三甲基氯化銨（GAT，河北百靈威超精細材料有限公司，純度95 %）；其他試劑均為分析純。

2 方法

2.1 陽離子化透明質酸衍生物（HA-GAT-LA）的制備[4]

取HA 10 g和GAT 10 g，混合，加入1 %（g/ml）氫氧化鈉水醇（4:1）混合溶液100 ml，于40±2 ℃保溫攪拌反應2 h，加入1 %乳酸鈉溶液400 ml，溶解并稀釋反應產物，過濾，收集濾液，加入95 %乙醇500 ml洗滌沉淀2次，去除上清，過濾收集沉淀，再加入95 %乙醇洗滌沉淀2次，40 ℃減壓干燥6 h，得白色顆粒狀粉末。

按上述方法，反應結束以10 %氯化鈉溶液代替10 %（g/ml）的乳酸-乳酸鈉溶液，制備未引入乳酸基團的陽離子化透明質酸鈉（HA-GAT）。

2.2 HA-GAT-LA季銨陽離子取代度和乳酸結合率的測定

以D2O為溶劑，采用Unity Inova 400核磁共振波譜儀對HA-GAT-LA進行1H-NMR檢測，譜圖分析時化學位移以TMS峰位置為標準，以透明質酸、季銨和乳酸基團甲基氫的比例，計算季銨陽離子取代度和乳酸結合率。

2.3 吸濕性和保濕性的測定

精密稱取HA、HA-GAT和HA-GAT-LA 各10 g，分別均勻平鋪于玻璃平皿中，厚度約2 mm，置92.5 %相對濕度（RH）環境48 h后，再分別置不同濕度環境（硅膠干燥器、43 %RH和81 %RH），于24，48 h取樣，測定樣品的干燥失重[5-6]，計算樣品的水分含量。

2.4 吸附量的測定

選取健康青少年未經燙染的黑色頭發，用1 %月桂基硫酸三乙醇胺水溶液浸漬1 min，然后用水清洗，再用吸水紙吸去水分，置硅膠干燥器干燥24 h。加入漂白液（5 %過氧化氫水和 2.5 %氨水按1:1混合），于30 ℃浸漬20 min，反復清洗和漂白10次，制成損傷毛發[7]。

分別取HA、HA-GAT-LA和HA-GAT 0.1 g，置入100 ml量瓶，加水溶解并稀釋至刻度，再稱取上述溶液4 g，置入50 ml量瓶，加水稀釋至刻度，獲得濃度約0.008 %的供試品溶液，取20 ml移至帶蓋試管中，置于 37 ℃水浴。精密稱量健康頭發和損傷頭發各2 g，置于供試品溶液中浸漬10 min。以咔唑顯色法[8]測定供試品溶液和浸漬毛發后供試品溶液糖醛酸含量，按下式計算毛發對HA、HA-GAT-LA和HA-GAT的吸附量（R）。

式中A0，A1分別為供試品溶液和浸漬毛發后供試品溶液經咔唑法顯色后在530 nm處的吸收度值。

2.5 掃描電鏡觀察

將2.3項下經HA、HA-GAT和HA-GAT-LA 3種供試液浸漬后的損傷毛發用吸水紙吸干水分，置平皿中于60±5 ℃烘干，和未經浸漬的毛發一起黏貼于樣品托上，噴金，置掃描電鏡下觀察。

2.6 頭發梳理試驗

取健康長頭發一束，分別用普通市售洗發水（對照組）和加入0.5 %HA-GAT-LA的洗發水（試驗組）揉洗1 min，大量清水沖洗至無泡沫，吸水紙吸干頭發表面水分，置頭發梳理儀測定濕梳摩擦阻力，用吹風機將頭發吹干之后，測定干梳摩擦阻力。

3 結果

3.1 HA-GAT-LA的陽離子取代度及乳酸結合率

HA-GAT收率＞80 %。1H NMR（400 MHz，D2O）δ：2.03（s，3H）；3.23（s，9H）。以透明質酸和季銨基團甲基氫的比例，計算HA-GAT的季銨陽離子取代度為0.76。

HA-GAT-LA收率＞85 %。1H NMR（400 MHz，D2O）δ：1.32～1.33（d，3H）；2.03（s，3H）；3.23（s，9H）。以透明質酸、季銨和乳酸基團甲基氫的比例，計算HA-GAT-LA的季銨陽離子取代度為0.76，乳酸結合率為85 %。

圖1 HA、HA-GAT和HA-GAT-LA的吸濕性

3.2 吸濕性和保濕性

結果見圖1。HA、HA-GAT和HA-GAT-LA在92.5 %RH高濕度環境放置48 h后，HA-GAT-LA水分含量遠遠大于HA和HA-GAT，說明在高濕環境中HA-GAT-LA能迅速吸收大量水分；充分吸濕后的樣品再分別置于有硅膠干燥劑的干燥環境中、43 %RH和81 %RH的中等濕度環境中，HA-GATLA和HA-GAT的水分均高于HA，而HA-GAT-LA表現尤其突出，在RH降低的情況下仍能保持較高含水量。以上結果表明，HA-GAT-LA的吸濕和保濕性能明顯好于HA和HA-GAT。

3.3 吸附量

結果見圖2。HA、HA-GAT和HA-GAT-LA浸漬損傷毛發和健康毛發后，在兩種毛發上的吸附量由高至低依次為HA-GAT-LA＞HA-GAT＞HA。結果表明，在透明質酸季銨鹽中引入乳酸基團可進一步提高透明質酸在毛發上的附著，HA-GAT-LA具有更好的吸附性能，效果優于HA和HA-GAT。

圖2 HA、HA-GAT和HA-GAT-LA在毛發上的吸附量

3.4 掃描電鏡觀察

結果見圖3。電鏡圖片顯示，健康毛毛鱗片規則整齊，貼附于毛桿，毛發表面光滑、突起較少。損傷毛毛鱗片變形，毛發表面粗糙、突起較多。經供試液浸漬之后，毛發均有不同程度的修復，毛鱗片更加貼服，其中HA-GAT-LA浸漬的損傷毛發表面光滑程度接近健康毛發，修復效果明顯好于HA和HA-GAT。

圖3 HA、HA-GAT和HA-GAT-LA浸漬毛發的掃描電鏡圖片

3.5 頭發梳理試驗

干梳摩擦阻力曲線和濕梳摩擦阻力分別見圖4、圖5，最大阻力見表1。結果顯示，用加入HA-GATLA的洗發水清洗頭發之后，濕發和干發的摩擦阻力均明顯減小，表明HA-GAT-LA可顯著改善頭發的柔順度。

圖4 健康頭發干梳摩擦阻力曲線

圖5 健康頭發濕梳摩擦阻力曲線

表1 健康頭發濕梳和干梳的最大摩擦阻力

4 討論

由于HA具有良好潤滑、保濕和生物相容性，被廣泛地應用于生物醫藥和化妝品領域。為了適應市場訴求的變化，研究者對HA分子進行改性，研制出多種類型的產品，以達到消費者、配方工程師對化妝品不同效果的需求。日本丘比公司通過化學修飾的方法將季銨陽離子基團引入HA，獲得的陽離子化HA（即HA-GAT）可用于皮膚和毛發的保濕和修復[7]。本研究通過化學修飾的方法將季銨陽離子乳酸鹽基團引入HA，制備得到陽離子化透明質酸衍生物HA-GAT-LA，季銨陽離子的引入改變了HA大分子表面的電荷，乳酸基團的引入進一步提高了HA的保濕和附著功能，效果優于未引入乳酸基團的HA-GAT，HA-GAT-LA能更好地吸附于毛發、皮膚的角質表面，發揮高吸濕、保濕和修復效果，有效提高毛發的柔順度，使毛發更容易梳理，保護其避免損傷，有望開發為新一代的日用化妝品原料。