苯磺貝他斯汀滴眼液中苯扎氯銨含量分析方法研究

方夏琴，檀華進，靳雯臻，姜 棟，譚曉川，張宇佳，鄭穩生

（北京協和醫學院，中國醫學科學院藥物研究所 藥物傳輸技術及新型制劑北京市重點實驗室，北京 100050）

苯磺貝他斯?。╞epotastine besilate）是一種組胺受體拮抗劑，屬于第二代H1抗組胺藥，主要特點是使用后起效迅速，具有良好的臨床效果與安全性[1-2]。該藥滴眼液劑型于2009年9月獲美國FDA批準上市，商品名為Bepreve，用于過敏性結膜炎相關性眼瘙癢的治療；目前尚未在國內獲批上市。另有研究報道苯磺貝他斯汀在治療過敏性鼻炎方面的有效性與安全性[3]。滴眼劑作為臨床上廣泛使用的一類高風險眼用制劑，在多劑量的眼用制劑中一般應加入適宜抑菌劑，以防止在制劑使用過程中微生物的污染；而不規范地添加抑菌劑會導致眼上皮細胞損害，給使用者造成安全風險；因此應盡量選用安全風險小的抑菌劑[4]。有研究人員通過專項評價發現，近年國產滴眼液中抑菌劑的應用逐漸得到重視[5]。抑菌劑的合理使用和質量控制在保證眼用制劑安全性、有效性方面具有十分重要的意義。

苯扎氯銨是一種具有殺菌作用的季銨鹽類陽離子化合物，廣泛用于復方消毒劑、化妝品、滴眼液、滴鼻液等，主要由正烷烴基取代的二甲基芐基氯化銨的同系物組成，其中最常用的同系物有十二烷基二甲基芐基氯化銨（C12-苯扎氯銨）、十四烷基二甲基芐基氯化銨（C14-苯扎氯銨）。苯扎氯銨在水溶液顯中性或弱堿性，振搖時易產生泡沫，屬消毒防腐劑類；且國內外苯扎氯銨質量存在較大差異[6]。目前，國內藥典收載的滴眼液品種中對抑菌劑的質量標準尚不完善，查閱發現，2015年版《中國藥典》收載了約43個滴眼液品種，其中僅11 個品種在質量標準中列入了抑菌劑含量檢查；且缺乏使用劑量和含量的控制研究，一定程度上造成抑菌劑選擇和使用不規范，存在一定的潛在安全風險。本文建立了苯磺貝他斯汀滴眼液中苯扎氯銨含量測定分析方法，為本類產品的質量控制研究提供參考。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Waters 2695高效液相色譜儀（美國Waters公司）；Agilent 1100高效液相色譜儀（美國Agilent公司）；AB-204型電子天平（Mettler）；PHS-3CW型pH計（上海般特儀器）；TGL-16G型離心機（上海安亭科學儀器廠）。

1.2 材料

苯扎氯銨對照品（批號：100549-201504，純度12.19 mg/ml，中國食品藥品檢定研究院）；苯磺貝他斯汀滴眼液（自制，規格為1.5 %）；乙腈（賽默飛世爾）；苯磺貝他斯?。ń靼柗ǜ呖扑帢I）；磷酸二氫鈉一水合物（南京化學試劑）；氯化鈉（河北華晨藥業）；苯扎氯銨（江西阿爾法高科藥業）；氫氧化鈉（湖南爾康制藥）；甲醇（賽默飛世爾）；三乙胺（西隴化工）；醋酸銨（北京化工廠）；磷酸（北京化工廠）；蒸餾水（廣州屈臣氏）。

親水性PTFE針式過濾器，疏水性PTFE針式過濾器，尼龍針式過濾器，水相聚醚砜針式過濾器（上海安譜實驗科技）；PTFE針式過濾器，尼龍針式過濾器，水相聚醚砜針式過濾器（津騰試驗設備公司）；芯硅谷混纖膜針式過濾器，芯硅谷PVDF針式過濾器，芯硅谷親水性PVDA針式過濾器（Aladdin Industrial Corporation）。

2 方法與結果

2.1 色譜條件與系統適用性

色譜柱：Agilent TC-C C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相為乙腈-5 mmol/L乙酸銨溶液（含1 %三乙胺，用磷酸調節pH值至5.0）=65:35，檢測波長214 nm，進樣20 μl，苯扎氯銨峰與相鄰峰的分離度應不小于1.5，拖尾因子0.8～1.5，理論塔板數3000以上；供試品中如含苯扎氯銨，按外標法以峰面積計算苯扎氯銨含量。

2.2 樣品的制備

2.2.1 供試品溶液的制備 取苯磺貝他斯汀滴眼液（含苯扎氯銨約0.05 mg/ml），過濾，棄去初濾液，取續濾液作為供試品溶液。

2.2.2 對照品儲備液的制備 取苯扎氯銨對照品適量，精密稱定，置入10 ml量瓶，加流動相溶解并定容至刻度，制成每1 ml中含苯扎氯銨1.219 mg溶液，作為苯扎氯銨對照品儲備液。

2.2.3 陰性溶液的制備 按處方量稱定磷酸二氫鈉一水合物和氯化鈉，加適量蒸餾水溶解，另取處方量苯磺貝他斯汀原料藥，加入上述溶液中，攪拌使溶解，用1.0 mol/L氫氧化鈉溶液調節上述溶液的pH至6.8，加蒸餾水至處方量，攪拌均勻；取適量過濾，棄去初濾液，取續濾液作為陰性對照溶液。

2.3 方法學驗證

2.3.1 專屬性考察 精密吸取空白溶劑、陰性對照溶液、對照品溶液和供試品溶液各20 μl，分別注入高效液相色譜儀，按2.1項下色譜條件分析，記錄色譜圖（見圖1），結果供試品溶液在對照品溶液主峰位置上有相同的色譜峰，溶劑和輔料與苯扎氯銨峰分離度符合要求，均對苯扎氯銨峰無干擾（見圖1），表明本方法專屬性良好。

圖1 苯扎氯銨專屬性HPLC圖譜

2.3.2 線性關系考察 精密量取2.2.2項下對照品儲備液1，3，1，5和3 ml，分別置入50，100，25，100和50 ml量瓶，均用流動相稀釋至刻度，搖勻，配制成濃度為0.02438，0.03657，0.04876，0.06095和0.07314 mg/ml系列苯扎氯銨對照品溶液；精密量取各20 μl，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖；以峰面積之和（A）為縱坐標，濃度（x）為橫坐標線性回歸，苯扎氯銨的線性回歸方程：A=2.453×107x+2.173×104，R2=1；表明擬定色譜條件下，苯扎氯銨在0.02438 ～ 0.07314 mg/ml范圍內，濃度與峰面積呈良好的線性關系。

圖2 線性試驗HPLC圖譜

2.3.3 檢測限與定量限 在214 nm波長下，當苯扎氯銨峰1信噪比為3時，檢測限為8 ng；當苯扎氯銨峰1信噪比為10時，定量限為23 ng。當苯扎氯銨峰2信噪比為3時，檢測限為39 ng；當苯扎氯銨峰2信噪比為10時，定量限為117 ng。

2.3.4 穩定性試驗 取本品供試品溶液，室溫放置，0，3，6，12，18，24 h，分別精密量取20 μl，注入液相色譜儀中，記錄色譜圖中的峰面積；峰面積之和的RSD為0.81 %（n=6）。表明供試品溶液穩定性良好。

圖3 穩定性試驗HPLC圖譜

2.3.5 儀器精密度 取本品對照品適量，加流動相制成每1 ml中含0.04876 mg的溶液。精密量取20 μl，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖，結果峰面積RSD為0.44 %（n=6），表明方法儀器精密度良好。

圖4 儀器精密度試驗HPLC圖譜

2.3.6 重復性 按2.2.1項下方法，分別平行配制6份供試品溶液，按色譜條件進樣分析，記錄色譜圖，6份供試品溶液的苯扎氯銨峰面積RSD為1.3 %（n=6），顯示本方法重復性好。

2.3.7 中間精密度 為考察隨機變動因素對精密度的影響，在不同的時間，由本實驗室另一名分析人員獨立操作，按2.2.1方法，配制6份供試品溶液，使用不同的高效液相色譜儀進行檢測分析，中間精密度試驗結果與重復性試驗的結果，12組數據合并計算RSD為1.70 %（n=12），結果表明，方法中間精密度良好。

2.3.8 回收率試驗 在陰性溶液中分別加入不同體積的苯扎氯銨對照品溶液，配制相當于苯磺貝他斯汀滴眼液處方中苯扎氯銨標示量（0.005 %）濃度的低、中、高3個濃度的回收率樣品溶液，并采用HPLC進行測定，以外標法計算樣品中苯扎氯銨含量及回收率（見表1）；結果表明，低、中、高3個濃度下苯扎氯銨含量測定方法回收率與RSD（n=9）均符合要求。

表1 回收率試驗

2.3.9 耐用性試驗 通過微調本試驗色譜條件中的流速、柱溫、色譜柱型號、流動相比例、檢測波長及pH等變動因素，以考察色譜條件中參數的微小變動對苯扎氯銨含量檢測方法主要色譜參數系統適用性的影響，評價該方法的耐用性。結果，在色譜條件微小波動情況下，苯扎氯銨色譜峰1與色譜峰2保留時間變化較小；其中相對其他條件的變動，色譜柱的改變對保留時間影響較大；但均符合系統適用性要求，表明本方法耐用性良好。

2.4 苯扎氯銨含量測定結果

取3批苯磺貝他斯汀滴眼液，按供試品配制方法，照2.1項下色譜條件， 采用HPLC分析苯磺貝他斯汀滴眼液中苯扎氯銨含量；按苯扎氯銨峰面積，以外標法計算，結果見表2。

表2 含量測定結果

結果表明，3批苯磺貝他斯汀滴眼液中苯扎氯銨含量均在80 %～120 %的標準范圍內，符合滴眼液中抑菌劑常規含量要求；表明本方法可用于檢查本品中苯扎氯銨含量。

2.5 濾膜強吸附性物質的檢測分析特性

2.5.1 濾膜材質吸附差異 采用不同廠家生產的不同材質的針式過濾器分別過濾不同體積的苯磺貝他斯汀滴眼液，按2.1項下色譜條件進行HPLC分析，按苯扎氯銨峰面積，以外標法計算苯磺貝他斯汀滴眼液中苯扎氯銨含量，考察濾膜來源、材質與過濾體積對苯扎氯銨的吸附差異。

以離心樣品為對比，采用安譜親水性PTFE、安譜疏水性PTFE、安譜尼龍、安譜水相聚醚砜、津騰PTFE、津騰聚醚砜、芯硅谷混纖膜、芯硅谷PVDF、芯硅谷親水性PVDF為濾膜過濾不同體積濾液樣品含量的RSD分別為：0.37 %，1.1 %，2.7 %，0.32 %，1.2 %，2.0 %，1.5 %，3.0 %，0.94 %。結果表明，安譜親水性PTFE、安譜水相聚醚砜、芯硅谷親水性PVDF針式過濾器對苯磺貝他斯汀滴眼液中苯扎氯銨吸附作用隨體積變化差異較小，吸附精密度較好；安譜疏水性PTFE、津騰PTFE、芯硅谷混纖膜吸附作用隨體積變化差異次之；安譜尼龍、津騰聚醚砜、芯硅谷PVDF針式過濾器隨體積變化表現出較強的吸附差異。結合含量數據分析發現，安譜親水性PTFE組平均含量與離心樣品相差0.93 %，而安譜水相聚醚砜組或芯硅谷親水性PVDF組平均含量與離心樣品相差2.3 %，2.5 %。

2.5.2 苯扎氯銨同系物吸附差異 在方法探究過程中，發現苯扎氯銨峰同系物的峰面積出現不同程度的吸附情況；故設計試驗進行吸附差異對比驗證。將同一批次的苯磺貝他斯汀滴眼液，分別采用不同材質的濾膜過濾不同體積的初濾液，并收集濾液作為待測樣品，照2.1項下色譜條件，進行HPLC分析，考察濾膜材質與過濾體積對苯扎氯銨兩種同系物的吸附差異。結果，親水性PTFE、疏水性PTFE、尼龍或水相聚醚砜過濾不同體積的苯扎氯銨兩種同系物峰面積之比的RSD分別為：1.9 %，3.5 %，11.2 %，2.0 %，親水性材質的PTFE或聚醚砜吸附差異可控約2 %，疏水性材質的PTFE或尼龍具有較強的吸附差異，且尼龍差異相比更高。表明，各濾膜對苯扎氯銨兩種同系物吸附作用不同，C鏈越長吸附作用越強，導致兩峰面積比例發生顯著變化；因此濾膜吸附情況評估，還需關注同系物類別。

綜上分析，提示采用安譜親水性PTFE為濾膜過濾，濾膜吸附可控性好。以盡可能排除濾膜吸附影響。

3 討論

國內關于苯磺貝他斯汀制劑及分析方法研究方面的文獻報道目前較少，包括苯磺貝他斯汀片的研制及體外評價[7]、苯磺貝他斯汀片劑的含量測定方法[8]及苯磺酸貝他斯汀滴眼液中異構體分析方法研究[9]等。本研究參照《中國藥典》2015年版中多個滴眼液品種中抑菌劑的常規檢查方法及文獻報道的抑菌劑含量分析經驗[10-11]，經方法摸索與優化，建立了苯磺貝他斯汀滴眼液中苯扎氯銨分析方法并進行方法學驗證。結果表明，該測定方法專屬性好，靈敏度較高，能有效控制本品中抑菌劑含量。

通常，為防止液相系統堵塞，HPLC樣品大多數情況下需經濾膜過濾才可進樣分析；其中針式過濾器由于使用方便快捷，在實驗室中應用廣泛。但苯扎氯銨可被多種濾膜吸附，特別是疏水或陰離子型濾膜[12]；上述試驗也提示本品種中苯扎氯銨可被濾膜吸附。因此，對苯磺貝他斯汀滴眼液中苯扎氯銨含量測定樣品的處理需注意其濾膜吸附作用，并確定濾膜材質與來源。多篇關于液體制劑中苯扎氯銨含量檢測的文獻均未重視濾膜吸附問題，且未列明所使用的的濾膜材質與來源；若濾膜選擇不當與不固定，可能導致“吸附不可控”造成的檢測結果“忽高忽低”的現象，存在較大的檢測風險。

通過互聯網檢索與了解其他廠家在研項目，發現滴眼液中苯扎氯銨檢查或生產線濾器的吸附情況具有一定的普遍性。在中試或生產過程中苯扎氯銨檢測結果若出現異常，需排查是生產過程濾器吸附問題，還是檢測樣品過濾環節的問題，分析異常原因，謹慎采取“過量投料”苯扎氯銨的措施，防止實際抑菌劑濃度過高，出現安全風險。因此，針對各品種抑菌劑使用的實際情況，需在質量標準中納入抑菌劑含量檢查項目，以控制高風險制劑滴眼液產品中抑菌劑含量符合要求及生產工藝重現性，保障人體用藥安全，具有一定的理論與實際意義。