復(fù)方肉蓯蓉合劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的研究

祝 宇，陳 鵬，余世榮，周 燦，桂利利，余惠凡，魏 娟*

（1. 十堰市人民醫(yī)院·湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬人民醫(yī)院 藥學(xué)部，湖北 十堰 442000；2. 武當(dāng)特色中藥研究湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 十堰 442000）

復(fù)方肉蓯蓉合劑是由肉蓯蓉、黨參、丹參、甘草等8味中藥制備而成的我院自制制劑，該制劑在老年病科臨床使用多年，療效確切，具有補(bǔ)腎填精、益氣養(yǎng)血、活血化濁、化痰開竅的功效[1]，主要治療腎虧氣虛兼痰瘀阻絡(luò)所致的輕、中度血管性癡呆癥[2]。

由于復(fù)方肉蓯蓉合劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制定時(shí)間較早，只測定了其相對密度、pH，及對君藥肉蓯蓉進(jìn)行定性鑒別，其他藥味定性鑒別缺失，尤其是含量控制指標(biāo)缺失，不能實(shí)現(xiàn)對復(fù)方肉蓯蓉合劑全面有效的質(zhì)控。有研究表明，毛蕊花糖苷、黨參炔苷及丹酚酸B都具有改善記憶力的作用[3-5]。因此，本研究增加了復(fù)方肉蓯蓉合劑中黨參、丹參的薄層色譜（TLC）鑒別方法，分別新建了肉蓯蓉、黨參、丹參中的毛蕊花糖苷、黨參炔苷及丹酚酸B含量測定方法。新的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)比原標(biāo)準(zhǔn)更加科學(xué)、全面，為提高和完善復(fù)方肉蓯蓉合劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

LC-20AT高效液相色譜儀（日本島津株式會(huì)社）；CP214十萬分之一電子分析天平（奧豪斯儀器上海有限公司）；Milli-QA10型超純水系統(tǒng)（美國默克密理博公司）；VGT-2013QT型超聲波清洗器（蘇州江東精密儀器有限公司）。

1.2 試藥

方中各味藥材均購于湖北神農(nóng)本草中藥飲片有限公司，酒蓯蓉（批號(hào)20170501，產(chǎn)地內(nèi)蒙），黨參片（批號(hào)20170601，產(chǎn)地甘肅），丹參（批號(hào)20170301，產(chǎn)地湖北），蜜遠(yuǎn)志（批號(hào)20170701，產(chǎn)地湖北），經(jīng)十堰市人民醫(yī)院藥檢室鑒定，均符合2015年版《中國藥典》一部的藥用標(biāo)準(zhǔn)；丹酚酸B對照品（批號(hào)：110629-201711）,丹參酮IIA對照品（批號(hào)：110766-201520，中國食品藥品檢定研究院）；黨參炔苷對照品（批號(hào)：wkp18100801），毛蕊花糖苷對照品（批號(hào)：wkp19011509），黨參對照藥材（批號(hào)：ycwkq18032107），丹參對照藥材（批號(hào)：140621，四川省維克奇生物科技有限公司）；復(fù)方肉蓯蓉合劑（十堰市人民醫(yī)院制劑中心生產(chǎn)，批號(hào)分別為170906，170907，170908）；缺黨參藥材的陰性樣品、缺丹參藥材的陰性樣品及缺肉蓯蓉藥材的陰性樣品均為按復(fù)方肉蓯蓉合劑處方比例及工藝，除去相應(yīng)藥味后制得；甲醇為色譜純，水為超純水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 TLC色譜鑒別

2.1.1 黨參TLC鑒別 取3批復(fù)方肉蓯蓉合劑（批號(hào)：170906，170907，170908）各10 ml，正丁醇萃取3次，每次10 ml，合并有機(jī)層并濃縮至5 ml，作為供試品溶液。取黨參對照藥材1 g，加水50 ml，回流提取1 h，放冷，同法制成對照藥材溶液。另取缺黨參藥材的陰性樣品10 ml，同法制備陰性對照溶液。再取黨參炔苷對照品，加甲醇制成每l ml含黨參炔苷1 mg的溶液，作為對照品溶液。分別吸取上述3 批供試品溶液、陰性對照溶液各5 μl，對照藥材溶液10 μl，對照品溶液3 μl，點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以正丁醇-冰醋酸-甲醇（7:1:1）混合溶劑為展開劑，展開，取出，電吹風(fēng)吹干，噴以10 %硫酸乙醇溶液顯色，吹干，紫外光燈（365 nm）下檢視。供試品色譜中，在與對照藥材色譜和對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)，且陰性對照無干擾[6]，見圖1。

圖1 復(fù)方肉蓯蓉合劑中黨參鑒別TLC圖譜

2.1.2 丹參TLC鑒別 取批號(hào)分別為170906，170907，170908的3批復(fù)方肉蓯蓉合劑各10 ml，用正丁醇萃取3次，每次10 ml，合并濃縮至5 ml，作為供試品溶液。取丹參對照藥材1 g，加水50 ml，回流提取1 h，放冷，同法制成對照藥材溶液。另取缺丹參藥材的陰性樣品10 ml，同法制備陰性對照溶液。再取丹參酮IIA對照品、丹酚酸B對照品，加甲醇制成每l ml分別含1 mg和0.5 mg的混合對照品溶液。分別吸取上述3 批供試品溶液和陰性對照溶液各5 μl，對照藥材溶液3 μl，混合對照品溶液3 μl，點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-甲苯-乙酸乙酯-甲醇-甲酸（6:4:8:1:4）混合溶劑為展開劑，展開，展至約離基線5 cm處取出，電吹風(fēng)吹干，再以乙酸乙酯-石油醚（1:6）為展開劑再次展開，展至約離基線10 cm處，取出，電吹風(fēng)吹干，噴以5 %香草醛的10 %硫酸乙醇溶液，電爐烤至斑點(diǎn)清晰，置于日光燈下檢視。供試品色譜中，在與對照藥材色譜和混合對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)，且丹參陰性對照無干擾[7]，見圖2。

圖2 復(fù)方肉蓯蓉合劑中丹參鑒別TLC圖譜

2.2 毛蕊花糖苷、黨參炔苷和丹酚酸B的含量測定

2.2.1 色譜條件 色譜柱：Diamonsil C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈-0.1 %磷酸溶液（19:81）；流速：1.0 ml/min；檢測波長：毛蕊花糖苷和黨參炔苷檢測波長分別為330，268 nm，丹酚酸B檢測波長為286 nm；柱溫：40 ℃；進(jìn)樣量：10 μl。

2.2.2 混合對照品溶液的制備 精密稱取毛蕊花糖苷對照品4.13 mg、黨參炔苷對照品16.38 mg及丹酚酸B對照品8.42 mg，置50 ml量瓶中，用50 %甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，0.45 μm微孔濾膜濾過，即得（質(zhì)量濃度分別為82.60，327.60，168.40 μg/ml，置于4 ℃冰箱中備用）。

2.2.3 供試品溶液的制備 精密吸取復(fù)方肉蓯蓉合劑溶液10 ml，用水飽和正丁醇萃取3 次，每次20 ml，合并正丁醇液，水浴蒸干，殘?jiān)?0 %甲醇適量使溶解，并轉(zhuǎn)移至20 ml量瓶中，加50 %甲醇稀釋至刻度，搖勻，0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.4 陰性對照品溶液的制備 分別取缺黨參藥材的陰性樣品、缺丹參藥材的陰性樣品及缺肉蓯蓉陰性樣品各10 ml，按2.2.3項(xiàng)下方法制成陰性樣品溶液。

2.2.5 專屬性考察 分別精密吸取混合對照品溶液、供試品溶液及陰性樣品溶液各10 μl，按上述色譜條件測定，記錄色譜圖，見圖3。供試品溶液的色譜圖中，在與混合對照品溶液色譜圖相應(yīng)的位置上，有相同保留時(shí)間的色譜峰，且陰性樣品溶液在此保留時(shí)間處無干擾。

圖3 復(fù)方肉蓯蓉合劑中毛蕊花糖苷、黨參炔苷和丹酚酸B含量測定HPLC圖譜

2.2.6 線性關(guān)系考察 分別精密吸取混合對照品溶液1.0，4.0，6.0，8.0，10.0 ml，置20 ml量瓶中，加50 %甲醇稀釋至刻度，搖勻。分別精密吸取上述對照品溶液各10 μl，注入高效液相色譜儀中，按2.2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析。以峰面積為縱坐標(biāo)、對照品質(zhì)量濃度（μg/ml）為橫坐標(biāo)對3種對照品進(jìn)行回歸分析，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明，毛蕊花糖苷、黨參炔苷和丹酚酸B分別在4.13～82.51 μg/ml、16.38～327.60 μg/ml、8.42～168.40 μg/ml范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系, 回歸方程分別為：Y=1.63×103X+4.63，r=0.9999；Y=4.39×106X-31.79，r=0.9998；Y=9.03×103X-1.67，r=0.9999。

2.2.7 精密度試驗(yàn) 取混合對照品溶液按上述色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄其峰面積，測得毛蕊花糖苷、黨參炔苷和丹酚酸B峰面積的RSD分別為為1.61 %，1.90 %，2.28 %（n=6），表明儀器精密度良好。

2.2.8 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一批次復(fù)方肉蓯蓉合劑（批號(hào)：170905），按2.2.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別于配制后在室溫下放置0，3，6，9，12，24 h后，按2.2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，記錄其峰面積，測得毛蕊花糖苷、黨參炔苷和丹酚酸B峰面積的RSD分別為0.81 %，2.15 %，1.41 %（n=6）。結(jié)果表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.9 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批次復(fù)方肉蓯蓉合劑（批號(hào)：170905），按2.2.3項(xiàng)下方法，平行制備6份供試品溶液，再按2.2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行分析，記錄其峰面積，測得毛蕊花糖苷、黨參炔苷和丹酚酸B峰面積的RSD分別為2.02 %，1.90 %，1.83 %（n=6）。結(jié)果表明該方法重復(fù)性良好。

2.2.10 加樣回收率試驗(yàn) 分別精密稱取毛蕊花糖苷對照品3.36 mg、黨參炔苷對照品0.76 mg、丹酚酸B對照品4.68 mg，置100 ml量瓶中，用50 %甲醇溶解并稀釋至刻度，配制成混合對照品溶液。精密量取已知含量的復(fù)方肉蓯蓉合劑（批號(hào)：170905）5 ml，共6 份，分別精密加入上述混合對照品溶液各5 ml，按2.2.3項(xiàng)下方法制成供試品溶液，再按2.2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，計(jì)算加樣回收率。結(jié)果得毛蕊花糖苷加樣回收率為97.58 %，RSD為1.23 %（n=6）；黨參炔苷加樣回收率為96.94 %，RSD為2.17 %（n=6）；丹酚酸B加樣回收率為97.20 %，RSD為1.44 %（n=6）。

2.2.11 樣品含量測定 取3批復(fù)方肉蓯蓉合劑（批號(hào)為170905，170906，170907）各3份，按2.2.3項(xiàng)下方法制備成供試品溶液，按2.2.1色譜條件進(jìn)樣分析，結(jié)果見表1。

3 討論

3.1 定性檢測藥材的選擇

本研究對復(fù)方肉蓯蓉合劑處方中8 味中藥的TLC鑒別按2015版《中國藥典》和參考文獻(xiàn)，分別開展系統(tǒng)性、專屬性和耐用性考察研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，黨參和丹參的TLC色譜具有特征斑點(diǎn)，且陰性對照無干擾。遠(yuǎn)志藥材中含極性相近成分，主斑點(diǎn)分離效果不佳；桂枝藥材中桂皮醛難溶于水，供試品溶液中無與對照藥材溶液相對應(yīng)的斑點(diǎn)；枸杞子、巴戟天和甘草藥材存在陰性對照干擾，故未將此5 味中藥的定性鑒別納入復(fù)方肉蓯蓉合劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

表1 復(fù)方肉蓯蓉合劑的含量測定（n=3）

3.2 定量指標(biāo)成分及其檢測波長的選擇

中藥復(fù)方制劑所含化學(xué)成分極其復(fù)雜[8]，單一指標(biāo)性成分并不能涵蓋復(fù)方肉蓯蓉合劑中全部藥效的物質(zhì)基礎(chǔ)，建立多指標(biāo)成分含量測定的質(zhì)量評價(jià)體系，對中藥復(fù)方制劑的質(zhì)量控制意義重大[9]。復(fù)方肉蓯蓉合劑處方中肉蓯蓉質(zhì)潤多液，具補(bǔ)腎陰、腎陽之功效，為君藥；黨參、丹參二藥合用，健脾益氣養(yǎng)血兼活血行瘀，既可補(bǔ)老年氣血之虧虛，又可輔佐君藥填補(bǔ)腎精，共為臣藥。因此，選擇肉蓯蓉、黨參和丹參藥材中的毛蕊花糖苷、黨參炔苷和丹酚酸B作為復(fù)方肉蓯蓉合劑中指標(biāo)性成分。對待測成分進(jìn)行全波長掃描，發(fā)現(xiàn)毛蕊花糖苷、黨參炔苷及丹酚酸B的最大吸收波長分別為330，286，268 nm，毛蕊花糖苷和丹酚酸B最大吸收波長相差較大，單一波長檢測無法使各成分均能達(dá)到較好的檢測靈敏度，故采用波長切換檢測法測定3指標(biāo)性成分含量。

3.3 藥材基原的影響

表1中3批次復(fù)方肉蓯蓉合劑含量測定中發(fā)現(xiàn)毛蕊花糖苷和黨參炔苷的含量波動(dòng)相對較大，在排除工藝穩(wěn)定因素外，筆者發(fā)現(xiàn)2015年版《中國藥典》收載的肉蓯蓉來源于列當(dāng)科肉蓯蓉和管花肉蓯蓉兩種植物[10]，而黨參來源于桔梗科植物黨參、素花黨參或川黨參[10]。由于藥材基原不同，在性狀特征、有效成分含量等方面存在差異性。因此，在擬定復(fù)方肉蓯蓉合劑的含量測定質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)時(shí)要充分考慮藥材基原不同帶來的影響，在藥材源頭確保制劑穩(wěn)定的可控性。