基于線粒體COⅠ基因的畜禽肉中鴨源性成分鑒別方法研究

盛中偉，唐修君，樊艷鳳，賈曉旭，陸俊賢，高玉時

(中國農業科學院 家禽研究所，江蘇省家禽遺傳育種重點實驗室，江蘇 揚州 225125)

民以食為天，食以安為先，從源頭做好動物源性食品安全，對保障人民群眾身體健康和維護社會公共衛生安全具有重要意義[1]。目前，肉與肉制品摻雜、摻假是重要的食品質量安全問題之一，“掛鵝頭賣鴨肉”、“假羊肉”、“牛肉膏”等畜禽肉摻假事件頻繁發生，嚴重威脅到消費者的健康和利益，如何快速有效地鑒別出畜禽肉中其它動物源性成分，關系到國計民生，也是各級質監部門對市場秩序維護的迫切需要。

隨著生物技術的發展，以DNA為基礎的分子生物學技術逐漸產生[2-4]，特別是熒光定量PCR技術的快速發展為肉類成分源性檢測開辟了新的途徑[5-8]。陸俊賢等[9]以豬特異性基因序列為靶位點設計特異性引物，建立了基于熒光PCR法的豬源性成分快速檢測方法。侯東軍等[10]根據線粒體環氧酶Ⅲ、細胞色素b和線粒體D-loop基因序列，分別設計了鴨、牛和豬特異性引物，并應用SYBR實時熒光PCR技術，定性識別了鴨、牛和豬源性成分。Dooley等[11]基于線粒體DNA細胞色素b基因，分別建立了畜禽肉中牛源性、豬源性、羊源性、雞源性和火雞源性的實時熒光定量PCR檢測方法。

動物線粒體基因組DNA具有母系遺傳、獨立的核外遺傳密碼以及進化速率快等優點，而且具有高度的物種特異性和多拷貝數，因此線粒體DNA多態性位點已成為設計肉類成分源性檢測的首選靶點[12-13]。其中COⅠ基因在動物系統進化、種類鑒別和群體遺傳多樣性研究等方面得到廣泛應用[14]。陳海港等[15]通過對mtDNA中COⅠ基因特異性位點比對和分析，設計并篩選出一對特異性引物XW1，成功的區分出云斑尖塘鱧和線紋尖塘鱧兩個物種。齊春萌等[16]根據鴕鳥mtDNACOⅠ基因序列特異性設計特異性引物，建立了肉制品中鴕鳥源性成分的實時熒光PCR鑒定方法。本研究擬根據鴨線粒體DNACOⅠ基因的差異性位點，設計篩選出鴨特異性引物，建立基于線粒體DNACOⅠ基因熒光定量PCR技術的畜禽肉中鴨源性成分快速檢測方法。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

豬肉、牛肉、羊肉、兔肉、雞肉、鴨肉、鵝肉、鴿肉和鵪鶉肉攪碎混勻成肉糜狀，-20 ℃保存備用；基因組DNA抽提試劑盒 北京天根生化科技有限公司；2×PCR Mix 南京博爾迪生物科技有限公司；熒光染料預混液SYBR Green mix：AceQ qPCR SYBR Green Master Mix 2500rxn 南京諾唯贊生物科技有限公司；電泳上樣緩沖液 寶生物工程(大連)有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 DNA提取 采用離心柱式組織基因組DNA小量抽提試劑盒分別提取9種動物肌肉組織DNA，同時將鴨肉DNA按10倍、102倍、103倍、104倍、105倍、106倍、107倍以及108倍等8個梯度進行稀釋，保存于-20 ℃備用。

1.2.2 引物設計與合成 以Genbank上公布的豬、牛、羊、兔、雞、鴨、鵝、鴿和鵪鶉等9種動物線粒體DNACOⅠ基因序列為靶基因，通過Arraydesigner 2.0、Oligo 6.0、Bioedit、Primer Premier 5.0等軟件比對分析，設計合成鴨特異性引物，由上海生工生物工程有限公司合成。引物信息見表1。

表1 引物序列、Tm值及PCR產物大小Table 1 Primer sequence，Tm value and the size of PCR product

1.2.3 常規PCR反應體系和條件 20 μL反應體系：2×PCR Mix 10 μL，10 μmol/L正向、反向引物各0.2 μL，DNA模板1 μL，雙蒸滅菌水8.6 μL。反應條件：95 ℃ 預變性5 min； 95 ℃變性 30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸 60 s，30個循環；72 ℃延伸10 min。1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增產物。

1.2.4 熒光定量PCR反應體系和條件 15 μL反應體系：Master Mix(2×) 7.5 μL；Dye 0.3 μL；1 μmol/L正向、反向引物各0.3 μL；DNA模板1 μL；雙蒸滅菌水5.6 μL。反應條件：50 ℃ 2 min； 95 ℃預變性10 min，95 ℃變性15 s，60 ℃ 1 min，40個循環。

1.2.5 靈敏度檢測 將鴨肉DNA模板稀釋10倍、102倍、103倍、104倍、105倍、106倍、107倍和108倍，以不同濃度DNA為模板，以10 μmol/L正向、反向引物檢測方法的靈敏度。反應條件同1.2.3和1.2.4.

1.2.6 數據處理 Real-time PCR擴增結束后，觀察擴增曲線圖，讀取循環閾值(cycle threshold，Ct 值)。若無典型擴增曲線且Ct值大于30，判定檢測體系無非特異性擴增。反之則認為檢測體系有特異性擴增。

2 結果與分析

2.1 線粒體DNA COⅠ基因常規PCR特異性和靈敏度檢測結果

所提取的豬、牛、羊、兔、雞、鴨、鵝、鴿和鵪鶉等9種動物肌肉DNA模板濃度經測定分別為157.67、141.46、206.52、178.7、174.57、198.24、115.61、191.43和125.62 ng/μL。以9種動物DNA為模板，以鴨線粒體DNACOⅠ基因引物對作為引物進行PCR擴增，結果見圖1。由圖可見，鴨物種特異引物對僅對鴨肉DNA 模板特異擴增出98 bp大小的條帶，而其它物種DNA模板無擴增。將鴨肉DNA模板按10倍梯度稀釋，檢測方法的靈敏度，結果見圖2。由圖可見，當DNA模板稀釋103倍時，仍可明顯見到特異性條帶，靈敏度較高。

圖1 常規PCR特異性檢測結果Fig.1 Specificity test results of PCR

圖2 常規PCR靈敏度檢測結果Fig.2 Sensitivity test results of PCR

2.2 線粒體DNA COⅠ基因熒光定量PCR特異性檢測結果

以9種動物肌肉DNA為模板，按照已優化的條件進行熒光PCR擴增，評價反應體系的特異性，具體見圖3、表2。鴨引物只有與鴨DNA模板反應才會有典型擴增曲線，Ct值為24.37；其余反應均無典型擴增曲線，Ct值大于30或無，且無非特異性擴增。

表2 不同動物DNA模板獲得的Ct值Table 2 The Ct value of different animal DNA template

圖3 鴨引物擴增曲線Fig.3 Amplification curve of duck primer

2.3 線粒體DNA COⅠ基因熒光定量PCR法靈敏度檢測

將鴨DNA模板按10倍梯度稀釋，分別采用0.03 μL和0.2 μL的引物體積，從DNA水平確定方法的檢測下限，擴增結果見表3、圖4、圖5。可見，當引物體積為0.03 μL時，既有典型擴增曲線，Ct值又小于30的情況下，鴨DNA模板稀釋倍數達到102倍，即濃度達到1.98 ng/μL；當引物體積為0.2 μL時，既有典型擴增曲線，Ct值又小于30的情況下，鴨DNA模板稀釋倍數可達105倍，即濃度達到1.98 pg/μL。

表3 鴨DNA模板不同稀釋倍數獲得的Ct值Table 3 The Ct value of different dilution ratio of different animals DNA templates

圖4 0.03 μL鴨引物在鴨DNA模板不同稀釋倍數下的擴增曲線擴增曲線從左到右稀釋倍數依次為稀釋10倍、102倍、103倍和104倍Fig.4 Amplification curve of different dilution ratio of 0.03 μL duck DNA primerFrom left to right of amplification curve, the dilutions were 10,102,103 and 104 times

圖5 0.2 μL鴨引物在鴨DNA模板不同稀釋倍數下的擴增曲線擴增曲線從左到右稀釋倍數依次為10倍、102倍、103倍、104、105、106和107倍Fig.5 Amplification curve of different dilution ratio of 0.2 μL duck DNA primerFrom left to right of amplification curve, the dilutions were 10,102,103,104,105,106 and 107 times

3 討 論

目前，熒光定量PCR技術憑借其獨特的優勢在食品肉類成分源性鑒別方面的應用越來越廣泛，該技術一方面提升了定性檢測的準確性，另一方面又使得定量檢測成為可能[17-18]，同時熒光定量PCR技術所需要的目標片段較短，樣品基本不會受到加工工藝流程等方面的影響。而且隨著以線粒體DNA編碼基因差異為靶基因進行的食品源性成分鑒定方法的不斷出現[12,19]，結合線粒體DNA和熒光定量PCR技術進行肉與肉制品中動物源性成分鑒別的研究技術已逐漸成熟。柳楠等[20]對線粒體16S rRNA引物進行了改進，成功檢測出近20種動物源性成分，大大提高了檢測的特異性和效率。林彥星等[21]根據鴨mtDNACOX基因上的保守序列設計特異性引物和TaqMan探針，建立了畜禽肉與肉制品中鴨源性成分熒光定量PCR檢測方法。

線粒體DNACOⅠ基因位于細胞線粒體中，具有變異位點多、易被通用引物擴增、序列很少存在插入和缺失等優點，已被廣泛用作DNA分類的標記基因[14,22]。梁瑞圓等[23]以山東小尾寒羊、洼地綿羊、蘇尼特羊、河北小尾寒羊和湖羊為研究對象，利用COⅠ基因特定片段為靶基因，探討mtDNACOⅠ基因作為DNA條形碼鑒定不同綿羊品種和系統進化的可行性。公月月等[24]基于線粒體COⅠ基因序列的特異性，構建了18種觀賞魚的系統進化樹，建立了18種觀賞魚的品種鑒定方法。

目前該基因在畜禽肉與肉制品中動物源性成分鑒別研究中報道甚少。本研究主要根據豬、牛、羊、兔、雞、鴨、鵝、鴿、鵪鶉等9種動物線粒體DNACOⅠ基因差異位點設計鴨特異性引物，并進行熒光定量PCR擴增檢測，觀察擴增曲線和Ct值，對9種動物畜禽肉進行鴨源性成分鑒別，經過多次重復試驗證明，所設計篩選的引物對只有在鴨模板DNA存在的情況下才會發生熒光PCR擴增，產生擴增曲線和Ct值，而對其它8種動物肌肉DNA模板無擴增，成功建立了快速、準確的基于線粒體DNACOⅠ基因的畜禽肉中鴨源性成分熒光PCR鑒別方法。研究結果為保障人們舌尖上的安全，打擊肉品市場摻假現象，維護市場秩序提供了技術支撐。

4 結 論

線粒體DNACOⅠ基因可以用作畜禽肉中鴨源性成分鑒別的靶基因。根據本研究結果可見本試驗所設計篩選的特異性引物對以及所建立的熒光定量PCR方法可以準確有效的進行畜禽肉中鴨源性成分檢測。