檳榔江水牛FEZL基因分離鑒定、分子特征及泌乳期多組織差異表達分析

張廣樂，吉 麗，王昌全，李成偉，保志鵬，苗永旺*

(1. 云南農業(yè)大學 動物科學技術學院，云南 昆明650201；2. 云南農業(yè)職業(yè)技術學院 畜牧獸醫(yī)學院，云南 昆明 650212；3. 云南省家畜改良工作站，云南 昆明 650224)

前腦鋅指蛋白(Forebrain embryonic zinc finger-like protein，F(xiàn)EZL)是鋅指蛋白超基因家族中的成員之一。鋅指結構是哺乳動物體內最豐富的蛋白質模體[1]。FEZL是包含6個C2H2鋅指結構的蛋白和一個甘氨酸重復區(qū)域[2]。C2H2型是典型鋅指，具有以下同源保守序列：-X-Cys-X2-4-Cys-X3-Phe-X5-Lue-X2-His-X2-6-His (X為可變氨基酸)[3]。每個鋅指結構是約30個氨基酸的微區(qū)，在Zn2+存在時折疊成ββα基序[4]。鋅指的串聯(lián)重復序列通常用于DNA或RNA識別，并且DNA識別由每個手指的α螺旋介導[4-5]。FEZL參與神經元發(fā)育的轉錄調控，已證實神經元發(fā)育與機體免疫之間通過下游細胞因子的表達存在關聯(lián)[6]。

FEZL基因位于普通牛第22號染色體上，包含6個外顯子和5個內含子，編碼序列 (coding sequence，CDS)全長為1 380 bp，6個外顯子的大小分別為27 bp、134 bp、907 bp、135 bp、133 bp和680 bp(登錄號：NM_001038198)。在普通牛中發(fā)現(xiàn)FEZL基因與乳腺炎相關聯(lián)。普通奶牛乳腺炎的易感性是由于信號肽5A (semaphorin 5A, SEMA5A) 基因的轉錄活性較低而導致的免疫反應受損所致[7]。乳腺炎誘導了FEZL基因在乳腺中表達，并通過FEZL誘導表達，進一步促進了SEMA5A的表達，進而誘導了與機體免疫相關的TNF-α和IL-8的表達[8]。FEZL也能誘導SEMA5A在易感牛中表達，但表達水平低于乳腺炎抗性牛[7]。在普通奶牛中發(fā)現(xiàn)FEZL基因編碼產物的多個甘氨酸殘基重復區(qū)長度存在12G和13G兩種類型，13G/13G 型的FEZL降低了SEMA5A的表達水平，導致該型奶牛對乳腺炎易感，發(fā)病率是12G/12G 型奶牛的2倍[9]。目前對水牛、羊等家養(yǎng)動物的FEZL基因研究報道較少。

近年由于高檔乳制品的市場拉動，水牛乳業(yè)得到了迅猛發(fā)展，水牛奶已經成為世界上第二大牛奶供應來源。相比于荷斯坦牛奶，水牛奶含有更高的乳脂、乳糖、乳蛋白和礦物質，營養(yǎng)豐富，具有良好的乳品加工特性[10]。迄今，有關乳腺炎抗性在水牛的研究較少，因此，開展水牛乳腺炎抗性的分子遺傳基礎研究十分必要。檳榔江水牛(Binglangjiang buffalo, BLJ buffalo)主要分布在云南西部檳榔江流域，其耐粗飼，抗病性強，泌乳性能好，牛奶品質佳，是中國水牛奶業(yè)發(fā)展的重要遺傳資源[11-13]。本研究分離鑒定了檳榔江水牛FEZL基因的編碼區(qū)，并且通過對其序列的功能生物信息學分析以及采用半定量RT-PCR技術對其進行了基因多組織差異表達分析，以揭示水牛FEZL基因的功能，為闡明水牛乳腺炎抗性的分子遺傳基礎提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

在云南省騰沖市采集4頭成年健康的泌乳期檳榔江水牛組織樣品，每頭牛分別取心、脾臟、肺臟、腎臟、大腦、小腦、垂體、乳腺、瘤胃、小腸、十二指腸等組織。采樣水牛飼養(yǎng)管理條件一致，年齡、胎次相近，無直接血緣關系。

1.2 組織總RNA提取與cDNA的合成

使用RNA抽提試劑盒(RNAiso Plus, Takara,中國大連)分離組織總RNA，用RNase-free水將產物溶解后檢測濃度和完整性。再使用Oligo(dT)18(500 μg/mL)和反轉錄試劑盒(Invitrogen M-MLV, Takara,中國大連)合成cDNA，并置于4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 引物設計和PCR擴增及測序

以普通牛FEZL基因mRNA序列(登錄號為NM_001038198)為模板，使用Primer premier 5軟件進行引物設計(表1)，用于分離水牛FEZL基因編碼區(qū)序列。

表1 水牛FEZL基因引物信息Table 1 Primer information of buffalo FEZL gene

PCR反應體系包含上、下游引物各0.6 μL (10 μmol/L)，Taq酶(5 U/μL)0.2 μL，10×buffer(Mg2+)4 μL，dNTPs 2.0 μL(2.5 mmol/L)，DNA模板(50 ng/μL)2.0 μL，加ddH2O至25 μL。PCR反應經94 ℃預變性3 min，然后94 ℃變性45 s， 52.6 ℃退火40 s， 72 ℃延伸1.5 min 進行35個循環(huán)，再72 ℃后延伸10 min，終止反應。PCR反應效果經2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，產物經膠回收純化后進行雙向測序，測序所用引物與PCR引物相同。

1.4 半定量RT-PCR檢測

以普通牛FEZL基因mRNA序列(GenBank登錄號為NM_001038198)為模板，同時以持家基因ACTB(GenBank登錄號為NM_001290932)為內參，設計半定量RT-PCR引物(表1)，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

半定量PCR反應體系包含上、下游引物各0.4 μL (10 μmol/L)，mix 5 μL(康為世紀生物技術有限公司)，cDNA模板(50 ng/μL) 1 μL，ddH2O加至10 μL。PCR反應首先94 ℃預變性3 min，然后94 ℃變性30 s， 65.2 ℃退火30 s， 72 ℃延伸30 s，進行35個循環(huán)，再后延伸72 ℃5 min，終止反應。以2%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR反應產物的完整性，電泳膠圖采用Quantity One軟件對分析，獲得表達量數(shù)據(jù)。

采用Lasergene軟件包(DNAstar Inc.)對序列進行核對與編輯，得到FEZL基因完整編碼區(qū)拼接序列，經ORF Finder程序(http://www.ncbi.nlm.gov/gorf/)確定開放閱讀框(open reading frame，ORF)，相對分子質量和等電點、疏水性、跨膜區(qū)和信號肽等理化特征通過在線軟件Compute pI/Mw tool、ProtParam tool、ProtScale、TMHMM server 2.0和SignalP 4.1 Server預測分析；采用ProtComp 9.0軟件進行FEZL的亞細胞定位；利用SOPMA程序對其蛋白質二級結構進行預測；通過NCBI數(shù)據(jù)庫預測蛋白質的保守結構域；基于同源建模法利用在線服務器SWISS-MODEL預測FEZL蛋白的空間三維結構；通過半定量PCR技術以及Quantity One軟件對多組織表達量進行檢測；最后采用Mega 4.0軟件基于鄰接法構建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結果與分析

2.1 PCR擴增與基因分離鑒定

采用RT-PCR法對FEZL基因進行擴增，PCR產物與預期擴增片段大小相同，電泳結果見圖1。

圖1 水牛FEZL基因的RT-PCR結果M. DNA相對分子質量標準DL2000;1. PCR產物Fig. 1 RT-PCR products of buffalo FEZL geneM. Marker-DL2000；1. product of PCR

PCR產物經測序得到1 593 bp的序列；通過與已發(fā)表的牛科物種序列比較，確定所得序列為水牛FEZL基因序列。檳榔江水牛完整的CDS為1 380 bp，編碼459個氨基酸，其氨基乙酸鏈的長度均為13G型(圖2)。將獲得的水牛FEZL基因CDS區(qū)序列提交到NCBI數(shù)據(jù)庫，獲得序列號：MK433000。FEZL基因CDS序列由21.30%A、28.26%G、16.45%T和33.99%C堿基組成。G+C含量為62.25%。水牛FEZL基因及其編碼的氨基酸序列見圖2。

圖2 檳榔江水牛FEZL基因的CDS全序列及其所編碼的氨基酸序列.FEZL多肽氨基乙酸鏈；.保守結構域：COG5048(289-440AA)；___. 起始密碼子；*.終止密碼子Fig.2 Complete CDS of BLJ buffalo FEZL gene and its encoded amino acid sequence. FEZL glycine chain sequence；. A conservative domainCOG5048 (289-440AA)；___. the start codon;*. the stop codon

2.2 基本理化特征

檳榔江水牛FEZL的基本理化特征與普通牛FEZL(13G型、12G型登錄號分別為AY644770，NM_001038198)比較結果見表2。疏水性分析表明水牛FEZL親水性平均值(GRAVY)為-0.324，表明水牛FEZL屬于親水性的蛋白質(圖3)。

表2 檳榔江水牛與普通牛FEZL的基本理化特征Table 2 Basic physicochemical characteristics of FEZL for BLJ buffalo and cattle

圖3 檳榔江水牛FEZL疏水性分析分值>0代表疏水性；分值<0代表親水性Fig. 3 Hydropathy analysis of BLJ buffalo FEZLscore>0 means hydrophobic; score<0 means hydrophilic

2.3 水牛FEZL蛋白的結構特征

檳榔江水牛FEZL蛋白的保守結構域見圖4。預測檳榔江水牛FEZL蛋白不含跨膜結構和信號肽，但含有1個COG5048保守結構域(289～440 AA)，為鋅指結構域。亞細胞定位分析表明，F(xiàn)EZL定位于細胞核內(支持率為100%)，為在細胞核內發(fā)揮功能作用的蛋白質。

圖4 檳榔江水牛FEZL蛋白保守結構域Fig. 4 Predicted conserved domain of BLJ buffalo FEZL

預測顯示，水牛FEZL中62.9%的AA構成無規(guī)卷曲、13.4%的AA構成α螺旋、15.1%的AA構成伸展鏈，8.6%的AA構成β轉折。三維結構預測顯示，檳榔江水牛FEZL與鼠鋅指蛋白568模板(5wjq.1.C)一致性為42%。該蛋白含有典型的鋅指結構，范圍在274～446 AA之間，與前面結構域分析基本一致。從FEZL的三維結構來看，水牛與普通牛的13G和12G型都有差異，但與普通牛13G型差異相對較小(圖5)。

圖5 預測的水牛FEZL蛋白三級結構a、b、c分別是預測的檳榔江水牛、普通牛13G型和12G型FEZL蛋白的3-D結構Fig. 5 Predicted tertiary structure of buffalo FEZL proteina,b and c are the predicted 3-D structures of the FEZLin BLJ buffalo, cattle 13G and 12G, respectively

2.4 序列一致性與系統(tǒng)樹分析

水牛FEZL氨基酸序列與13G型普通牛的一致性為99.6%；與12G型普通牛(Bostaurus)、瘤牛(Bosindicus)和山羊(Caprahircus)的一致性為99.3%；與綿羊(Ovisaries)和白尾鹿(Odocoileusvirginianus)的一致性為99.1%；與馬(Equusasinus)和澳洲野狗(Canislupusdingo)的一致性為97.8%；與人(Homosapiens)的一致性為97.4%(圖6)?；跈壚平EZL氨基酸及其同源序列構建的系統(tǒng)發(fā)育樹見圖7。在系統(tǒng)發(fā)育樹上，水牛與普通牛、瘤牛和山羊、綿羊等聚在一大支上，支持率為99%；而人、馬和澳洲野狗聚在另一支上。

圖7 基于檳榔江水牛和其他物種的FEZL氨基酸序列的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.7 Phylogenetic tree based on FEZL aminoacid sequences of BLJ buffalo and other species

2.5 組織差異表達分析

采用半定量RT-PCR方法，檢測成年泌乳期水牛FEZL基因在12個器官組織中的差異表達。FEZL基因在水牛大腦中表達量最高，在心、脾、肺、腎、小腦、垂體組織中表達水平次之，在乳腺、小腸、肌肉、十二指腸中有少量表達，在瘤胃中有微量表達(圖8)。

圖8 泌乳期檳榔江水牛FEZL基因的多組織表達譜ACTB基因表達作為內參;M. DL2000 DNA marker;1. 心臟;2. 脾臟;3. 肺;4. 腎;5. 小腦;6. 大腦;7. 垂體;8. 肌肉;9. 乳腺;10. 瘤胃;11. 十二指腸;12. 小腸Fig.8 Multi-tissue expression profile of FEZL gene inlactating BLJ buffaloThe ACTB expression served as an internal control.M. DL2000 DNA marker;1. heart;2. spleen;3. lung;4. kidney;5. cerebellum;6. the brain;7. pituitary;8. muscle;9. breast;10. rumen;11. duodenum;12. small intestine

3 討 論

作為鋅指蛋白家族中的重要的成員，F(xiàn)EZL在動物體神經發(fā)育過程中發(fā)揮著重要作用[17]。有研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)EZL基因與普通奶牛的乳腺炎有著密切的關聯(lián)[6]，但關于FEZL基因在水牛的研究上報道較少。為了闡明該基因在水牛中的功能，基于普通牛FEZL基因的序列，本研究分離鑒定了檳榔江水牛FEZL基因的CDS序列。通過序列測定和序列比對分析，確定所得到的序列就是水牛FEZL基因完整的CDS序列，并進一步預測了其理化特性與結構特征。在FEZL基本的理化特性和結構上，水牛與普通牛較為相似。序列一致性與系統(tǒng)發(fā)育分析表明，水牛FEZL氨基酸序列與哺乳類動物特別是?？莆锓N的FEZL序列一致性較高，在系統(tǒng)樹上聚在一起。以上揭示水牛FEZL在功能上與?？莆锓N的FEZL較一致。通過蛋白質結構特征分析，發(fā)現(xiàn)檳榔江水牛FEZL蛋白含有一個COG5048保守結構域，為含有6個C2H2的鋅指結構域。該結構域是典型的細胞核內反式作用因子與靶基因調控序列的結合域。近年研究表明，F(xiàn)EZL是一種在神經元發(fā)育中起作用的轉錄因子，據(jù)報道FEZL缺陷小鼠顯示出過度活躍的行為，表明FEZL在神經元發(fā)育中起作用[6]。由此推斷，檳榔江水牛的FEZL也是作為細胞核內的一種轉錄因子，參與了有關基因的表達調控過程。

在普通奶牛中已揭示乳腺炎能夠誘發(fā)乳腺中FEZL基因的表達，F(xiàn)EZL基因編碼產物能夠促進細胞中SEMA5A的表達，SEMA5A表達量提高可以引起與機體免疫反應相關的TNF-α和IL-8等多個基因的表達[8]。研究表明，在普通奶牛FEZL基因編碼產物存在一個GGC(甘氨酸)的插入突變導致FEZL的氨基乙酸重復區(qū)長由12G變成13G, 12G/12G型奶牛SEMA5A的表達水平高，導致多個與機體免疫相關的基因的表達上升，使該型奶牛對乳腺炎表現(xiàn)為抗性，而13G/13G類型奶牛則相反，SEMA5A 的表達水平下降，表現(xiàn)對乳腺炎易感[9]。此外，研究發(fā)現(xiàn)，胰島素樣生長因子1受體(IGF1R)的表達量的增加對奶牛乳腺炎的易感性也有增強作用，13G型FEZL基因比12G型FEZL基因更能增加IGF1R的表達量[14]。河流型水牛乳腺炎只有4%左右的發(fā)病率[15-17]，而沼澤型水牛未見有患乳腺炎的報道。本文檢測的檳榔江水牛都未感染乳腺炎，本研究及之前檢測結果[7]顯示，水牛的FEZL均為13G/13G類型，提示水牛FEZL通過SEMA5A信號通路所起的免疫調控作用可能與普通牛有所差異。且在理化特性上，水牛的FEZL與普通牛的FEZL(13G型、12G型)存在一定的差異，主要表現(xiàn)在其疏水性氨基酸與極性氨基酸的組成、不穩(wěn)定系數(shù)及親水性等方面；在三級結構上，水牛FEZL蛋白的三級結構與普通牛FEZL的兩種類型也存在一定差異。這些揭示作為轉錄因子的FEZL對靶基因的調控，水牛與普通牛存在差異，但這是否與水牛不易患乳腺炎有關，需進一步研究。

本研究通過多組織差異表達分析，檢測到FEZL基因在所檢測的泌乳期水牛12個組織中都有表達，其中在大腦中的表達量最高，在瘤胃中的表達量最低。這揭示FEZL基因作為一種轉錄因子，在水牛的多個組織中均發(fā)揮作用。該基因在水牛大腦中的表達量最高，揭示該基因與神經功能相關。已有研究發(fā)現(xiàn)，在斑馬魚中，F(xiàn)EZL是基底前腦中單胺能(多巴胺能和5-羥色胺能)神經元發(fā)育所必需的[18]。Chen等[19]研究發(fā)現(xiàn)，在FEZL缺陷小鼠中，深層皮質層中神經元的發(fā)育或多或少是異常的，用小干擾RNA(siRNAs)敲除FEZL會改變V層錐體神經元的樹突形態(tài)。本研究檢測到FEZL在水牛乳腺中有少量表達，這揭示FEZL基因參與了水牛的泌乳過程，至于該基因參與水牛的泌乳過程的具體作用機制還需進一步研究。

4 結 論

本研究揭示了水牛FEZL的理化特性及結構特征，發(fā)現(xiàn)FEZL基因在檢測的所有水牛組織中都有表達，其中在大腦中的表達量最高。初步確定水牛FEZL基因可能在水牛中作為一類核內轉錄因子廣泛參與基因的表達調控過程。確定水牛中FEZL氨基乙酸鏈的長度均為13G/13G型，鑒于水牛不易感乳腺炎的特性，提示水牛FEZL參與相關基因的調控過程可能與普通牛中有差異。