熒光PCR探針熔解曲線法檢測結核分枝桿菌對利福平和異煙肼耐藥情況的研究

蘇碧儀 周德旺 馬品云 關平 譚耀駒

結核病是嚴重危害人類健康的傳染病之一，耐多藥結核病(MDR-TB)的出現使結核病的防控形勢更加嚴峻。MDR-TB全球分布不均，印度和中國是全球MDR-TB疫情最嚴重的國家，每年新發MDR-TB患者數占全世界的50%以上，并且有不斷上升的趨勢[1]。快速診斷和治療MDR-TB，對結核病防控很有意義。BACTEC MGIT 960液體培養藥物敏感性試驗(簡稱“MGIT 960藥敏試驗”)需要2～4周，往往延誤了耐藥結核病患者的診治。隨著結核分枝桿菌耐藥機制的研究，通過檢測耐藥相關基因突變的快速分子生物學檢測方法日益受到重視[2-4]。耐藥基因檢測法可以及時診斷耐藥肺結核，及早治療，防止耐藥結核病的傳播。本研究用熒光聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction, PCR)探針熔解曲線法(簡稱“熔解曲線法”)檢測結核分枝桿菌復合群對利福平和異煙肼的耐藥基因突變，并與MGIT 960藥敏試驗結果進行比較，評價其快速診斷利福平和異煙肼耐藥性的檢測效能及臨床意義。

資料和方法

一、 樣本和試劑

1.樣本來源：收集2018年1—12月廣州市胸科醫院收治的832例涂陽肺結核患者痰標本。

2.主要試劑：(1)MGIT 960培養管，營養添加劑(OADC)，雜菌抑菌劑(PANTA)均購自美國BD公司；(2)結核分枝桿菌利福平耐藥基因突變檢測試劑盒和結核分枝桿菌異煙肼耐藥基因突變檢測試劑盒均購自廈門致善生物科技有限公司；(3)磁珠法核酸提取試劑由廈門致善生物科技有限公司生產。

3.主要儀器：(1)BACTECTMMGITTM960系統購自美國BD公司；(2)全自動醫用PCR分析系統(型號：SLAN-96P) 由上海宏石醫療科技有限公司生產；(3)Lab-Aid 824核酸提取儀由廈門百維信生物科技有限公司生產。

二、 實驗方法

1. 本研究收集832例涂陽肺結核患者痰標本進行MGIT 960液體培養，結果顯示陰性52例(6.3%)，污染35例(4.2%)，陽性745例(89.5%)。對745份陽性培養物進行菌種鑒定(生物芯片法)，其中，678份(91.0%)為結核分枝桿菌復合群，60份(8.0%)為非結核分枝桿菌(nontuberculous mycobacteria，NTM)，7份(1.0%)為混合感染。對678例患者的痰標本進行MGIT 960藥敏試驗和熔解曲線法耐藥基因檢測。患者標本檢測流程見圖1。

圖1 患者標本檢測流程圖

2. MGIT 960液體培養：按照操作規程，OADC和PANTA 1∶1混合后(臨時配制)，每支MGIT 960培養管加入800 μl含PANTA的OADC備用，將832份涂陽痰標本進行液化處理：取3 ml痰標本置于50 ml 離心管內，加入2倍痰標本體積消化液(4%氫氧化鈉溶液與2.9%枸櫞酸鈉溶液1∶1混合)，振蕩20 s，靜置15 min，再加入磷酸鹽緩沖液(pH值6.8)至45 ml， 3000×g離心15 min，棄去上清液，加入1 ml緩沖液，混勻備用，取500 μl液化后痰標本加入到上述MGIT 960培養管中，于BACTECTMMGITTM960系統中培養。剩余液化后痰標本收集在2 ml離心管中，用于熔解曲線法的檢測。

3.MGIT 960藥敏試驗：將832份涂陽痰標本進行培養， BACTECTMMGITTM960儀器報告陽性的標本先進行抗酸涂片，驗證MGIT 960培養管內的培養物是否為抗酸桿菌。如果是抗酸桿菌，則采用基因芯片法進行菌種鑒定，確定678份陽性培養物為結核分枝桿菌復合群，再對其進行利福平和異煙肼耐藥性檢測。

4. 熔解曲線法：經液體培養、菌種鑒定后，得到678份鑒定為結核分枝桿菌復合群的陽性培養物，將678份鑒定為結核分枝桿菌復合群的陽性培養物對應的痰標本進行熔解曲線法檢測。按照熔解曲線試劑盒說明書操作。結果顯示利福平耐藥性檢測結果無效(無法判斷是否耐藥)31例，異煙肼耐藥性檢測結果無效34例，剩余639例利福平和異煙肼同時檢測結果有效。

三、統計學處理

使用SPSS 17.0軟件進行統計學分析。以 MGIT 960藥敏試驗結果為參考標準，評價熔解曲線法檢測利福平和異煙肼耐藥性的效能。Kappa值≥0.75表示二者之間一致性非常好，Kappa值0.4～0.75表示二者一致性較好，Kappa值≤0.4表示二者一致性較差。

結 果

639例患者的痰標本同時獲得MIGT 960液體藥敏試驗和熔解曲線法對利福平和異煙肼耐藥性檢測結果。

MGIT 960藥敏試驗檢測對利福平的耐藥率為21.1%(135/639)，對異煙肼的耐藥率為29.6%(189/639)；熔解曲線法檢測對利福平的耐藥率為22.1%(141/639)，對異煙肼的耐藥率為26.0%(166/639)。

以MGIT 960藥敏試驗結果為參考標準， 639例患者痰標本熔解曲線法對利福平耐藥性檢測結果有615例與MGIT 960液體藥敏試驗檢測結果一致，符合率為96.2%，敏感度和特異度分別為93.3%(126/135)和97.0%(489/504)，Kappa值為 0.89，一致性非常好；639例患者痰標本熔解曲線法對異煙肼耐藥性檢測結果有598例與MGIT 960液體藥敏試驗檢測結果一致，符合率為93.6%(598/639)，敏感度和特異度分別為83.1%(157/189)和98.0%(441/450)，Kappa值為0.84，一致性非常好(表1)。

討 論

近年來，MDR-TB已成為我國結核病防控領域的主要難題，早期檢測結核分枝桿菌對利福平和異煙肼的耐藥性不僅可以提高患者治愈率，同時也可以阻斷耐藥結核病在人群中的傳播，對耐藥結核病的防治具有重要意義。

本研究發現，熔解曲線法檢測利福平耐藥結果無效31例，檢測異煙肼耐藥結果無效34例，對上述檢測標本的陽性級別進行核對，筆者發現大部分樣本為低陽性級別標本(涂片結果為實際條數或者“+”)。有研究表明，熔解曲線法的檢測下限為100 菌落形成單位(CFU)/ml[5]。因此，標本中結核分枝桿菌含量較低可能造成核酸擴增及檢測失敗。

本研究結果表明，熔解曲線法進行結核分枝桿菌復合群對利福平和異煙肼的耐藥性檢測具有較高效能，其對利福平耐藥性檢測的敏感度(93.3%)與線性探針(94.3%)[6]持平并高于基因芯片(84.4%)[7]。這主要得益于熔解曲線法能夠檢測結核分枝桿菌混合感染，從而提高了對利福平耐藥性檢測的敏感度。同時對異煙肼的敏感度(83.1%)高于線性探針(77.4%)[6]和基因芯片(80.9%)[7]，一方面，熔解曲線法能夠檢測混合感染；另一方面，熔解曲線法不僅檢測包括katG和inhA兩個耐藥相關基因，同時也檢測oxyR-ahpC基因。有研究表明，我國對異煙肼耐藥的菌株中有約3%攜帶oxyR-ahpC基因突變，因此熔解曲線法藥敏試驗檢測的覆蓋范圍更廣，可以提高對異煙肼耐藥性檢測的效能[8]。

表1 以MGIT 960液體藥敏試驗為參考標準評價熔解曲線法檢測利福平、異煙肼耐藥性的效能

雖然本研究表明熔解曲線法與MGIT 960 液體藥敏試驗檢測結果具有較高的一致性，但是也發現兩者檢測結果存在不一致的情況，對利福平和異煙肼的耐藥性檢測陽性檢出率也存在差異，這種差異是客觀存在的；分子生物學檢測技術檢測耐藥結核病的敏感度尚未達到100%，對利福平和異煙肼耐藥性檢測的敏感度僅為95%和85%[9]；分子生物學檢測方法通常在標本中耐藥結核分枝桿菌復合群占比高于20%以上時才能檢出，因此造成部分耐藥結核分枝桿菌復合群的漏檢[10]，表型藥敏試驗結果通常為耐藥的結果；而熔解曲線法可能無法檢出耐藥結核分枝桿菌復合群占比低于20%的標本，導致將標本判定為敏感。表型藥敏試驗結果雖然是當前耐藥性檢測的金標準，但仍存在局限性，往往對于一些低水平耐藥的菌株存在漏檢的情況；如分子藥敏試驗檢測出rpoB基因511位點和inhA突變時，表型藥敏試驗往往檢測結果為陰性，因此造成兩種方法檢測結果不一致[11]。有研究表明，如果分子藥敏試驗檢測結果為耐藥，而表型藥敏試驗檢測結果為敏感時，進行再次重復檢測，通常為表型藥敏試驗檢測結果錯誤[12]。另外，引起耐藥的機制有3種，分別是細胞壁通透性改變、外排泵機制和基因突變[13]。熔解曲線法只是檢測基因突變，如果是基因突變外的耐藥機制引起，就會導致表型藥敏試驗耐藥而熔解曲線法檢測敏感的情況。

總之，以MGIT 960液體藥敏試驗作為參考標準評價熔解曲線法藥敏試驗檢測利福平和異煙肼的耐藥性具有較高的一致性，Kappa值均>0.75，一致性非常好。熔解曲線法能直接采用痰標本進行耐藥性檢測，不需得到臨床分離菌株，大大縮短了檢測時間；具有對利福平和異煙肼耐藥檢測簡單、快速、敏感度高、特異度好的優點，對于耐多藥肺結核的早期診斷有重要意義。