結(jié)核病比較免疫學(xué)時代的機(jī)遇和挑戰(zhàn)

朱國峰 劉曉清

結(jié)核病領(lǐng)域每一個歷史性階段的進(jìn)步發(fā)展都有著共同的歷程和特點(diǎn)，即在當(dāng)時已有的先進(jìn)技術(shù)和理論基礎(chǔ)上，通過一定階段系統(tǒng)全面的實(shí)驗、觀察和總結(jié)，形成水平與能力都得到提高和發(fā)展的新的階段性的結(jié)論、認(rèn)識和問題。在這個階段技術(shù)能力支持下的成果獲得日益豐富的積累，也就必然會提出新的有待深入研究的問題，要求更進(jìn)一步的工作和新技術(shù)來解決這些問題。也就是說，每一個階段科研的成熟和進(jìn)步，都在為下一個階段升級的科學(xué)研究和進(jìn)步提供研究所需要解決的科學(xué)問題和社會需求，同時對解決這樣的科學(xué)問題所需要的功能技術(shù)提出了方向和要求。在國際結(jié)核病研究領(lǐng)域中，從20世紀(jì)90年代初到現(xiàn)在，這個規(guī)律表現(xiàn)得尤為突出。

以1998年結(jié)核分枝桿菌(MTB)全基因組測序完成為標(biāo)志，全球結(jié)核病免疫學(xué)研究已經(jīng)進(jìn)入了分子免疫學(xué)的全新時代。隨著MTB基因敲除突變體技術(shù)的成熟和普及，隨著全球結(jié)核病新型有效疫苗和藥物研發(fā)評價需求的日益迫切，隨著結(jié)核病小鼠、豚鼠和猴子三種動物模型全面的建立和成熟，作為結(jié)核病領(lǐng)域研究的核心技術(shù)和理論，結(jié)核病分子免疫學(xué)的研究迅速跨入一個急劇擴(kuò)張和爆發(fā)的全面創(chuàng)新階段。

以MTB基因敲除突變體和動物模型兩大類技術(shù)為核心的結(jié)核病免疫學(xué)研究，正在逐漸積累并形成結(jié)核病比較免疫學(xué)數(shù)據(jù)體系(不同宿主類型結(jié)核病免疫反應(yīng)特征，MTB不同基因免疫調(diào)控功能)，為我們?nèi)嫔羁陶J(rèn)識結(jié)核病的免疫控制機(jī)理，以及深刻認(rèn)識掌握宿主免疫反應(yīng)調(diào)控機(jī)理和技術(shù)，為全新的結(jié)核病疫苗研究、結(jié)核病新藥物研究、結(jié)核病新型免疫診斷技術(shù)研究提供了前所未有的機(jī)會和可能。我國結(jié)核病基礎(chǔ)研究和應(yīng)用研究的水平和未來，能否在全球結(jié)核病疫苗、藥物和診斷技術(shù)的競爭中占據(jù)一席之地，其關(guān)鍵就在于能否把握住結(jié)核病比較免疫學(xué)形成和發(fā)展的這個歷史機(jī)遇，形成真正具有國際水平的結(jié)核病免疫學(xué)科學(xué)和技術(shù)研究的實(shí)力和能力。

一、結(jié)核病免疫學(xué)研究的重要性

(一)MTB感染的特點(diǎn)

1. 胞內(nèi)菌。MTB是一種巨噬細(xì)胞內(nèi)寄生的高度適應(yīng)宿主免疫反應(yīng)的致病細(xì)菌，無論在體內(nèi)生長還是體外培養(yǎng)，MTB都表現(xiàn)出生長緩慢的特點(diǎn)。在研究中發(fā)現(xiàn)，MTB在很多細(xì)胞中都能表現(xiàn)出對宿主細(xì)胞內(nèi)環(huán)境很強(qiáng)的適應(yīng)性，如抵御NO等含氮活性化合物，抑制細(xì)胞膜融合等[1]。

2. 潛伏感染。在絕大多數(shù)的感染事件中，MTB的感染并不直接導(dǎo)致宿主發(fā)病，而是以潛伏的狀態(tài)存在于宿主體內(nèi)一種特別的結(jié)構(gòu)中，也就是結(jié)核肉芽腫中。結(jié)核肉芽腫是由多種免疫細(xì)胞聚集復(fù)合而成的病理結(jié)構(gòu)，多數(shù)情況下宿主能夠有效將細(xì)菌控制在肉芽腫組織中而健康地生活[2-3]。

3. 潛伏感染復(fù)發(fā)。在潛伏感染的過程中，當(dāng)宿主不能將細(xì)菌有效控制在肉芽腫組織中時，宿主將會發(fā)病。這樣的情況多數(shù)發(fā)生在宿主免疫反應(yīng)抑制時，如罹患艾滋病和臨床應(yīng)用免疫抑制劑治療自體免疫性疾病，以及在營養(yǎng)不良的情況下[3]。

(二)人類對疫苗的需求和努力

卡介苗(BCG)是一種減毒的牛分枝桿菌，是全球唯一廣泛使用的抗結(jié)核疫苗，從1921年起，全球至少接種了30億份BCG。在成年人中，BCG的保護(hù)效率在不同的臨床試驗中表現(xiàn)出很大的差異，從0.0%到80.0%的數(shù)據(jù)都有。尋找更安全和更加有效的結(jié)核病新疫苗，是全球結(jié)核病防控的迫切需要[4]。

在近年來的結(jié)核病疫苗研究中，下面2個候選疫苗的臨床試驗結(jié)果需要大家有正確的認(rèn)識和理解。

1. MVA85A。這是進(jìn)入21世紀(jì)以來曾經(jīng)寄托了所有人最大希望的一個結(jié)核病新疫苗。這個疫苗以表達(dá)Ag85A免疫原的Ankara病毒為載體，通過表達(dá)抗原85A以提高接種過BCG的嬰兒(4～6個月齡)保護(hù)效果。隨著在2013年該疫苗評估的臨床2b期試驗結(jié)果公開發(fā)表，無明顯保護(hù)效果的結(jié)論再一次強(qiáng)烈提示：在對于結(jié)核病免疫反應(yīng)特性認(rèn)識仍然非常淺顯的情況下，尋找和發(fā)現(xiàn)結(jié)核病新疫苗是需要對結(jié)核病保護(hù)性免疫反應(yīng)有更多研究才會成為可能[5]。在結(jié)核病免疫機(jī)理研究和新型疫苗研究的歷史上，MVA85A的研發(fā)過程和結(jié)果具有非常重要的理論和技術(shù)價值，即試圖用簡單盲選的辦法挑揀免疫原開發(fā)結(jié)核病新型有效疫苗的方法，對于結(jié)核病這樣免疫過程機(jī)理復(fù)雜的傳染病是行不通的。只有對于結(jié)核病的免疫機(jī)理有了充分翔實(shí)的實(shí)驗機(jī)理研究后，才有可能研發(fā)出新的、有效的結(jié)核病疫苗。

2. M72/AS01E。這是一個以MTB32A和MTB39A兩個MTB蛋白為免疫原，結(jié)合AS01佐劑的結(jié)核病新疫苗。臨床試驗評估人群為18～50歲且無HIV感染的MTB潛伏感染者。在2018年發(fā)表的該疫苗臨床 Ⅱb 期評價的結(jié)果顯示，與接種安慰劑對照的測試組相比，其對MTB潛伏感染者的保護(hù)效率為54%。這個結(jié)果顯示，關(guān)于這個候選疫苗的作用仍需要進(jìn)一步評價，尤其是要對不同類型人群進(jìn)行多點(diǎn)評價[6]。

(三)缺乏保護(hù)性免疫反應(yīng)的標(biāo)志

宿主對MTB的控制是非常復(fù)雜活躍的一系列免疫活動。在這個過程中，主要的免疫細(xì)胞(如巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞等)都在其中扮演著一定的角色。然而在對結(jié)核病保護(hù)性免疫反應(yīng)的判斷標(biāo)準(zhǔn)上，卻始終缺乏明確的判斷方法。MTB能夠激發(fā)宿主強(qiáng)烈的免疫反應(yīng)，但在諸多不同的反應(yīng)中，哪些反應(yīng)是對宿主起保護(hù)作用的？哪些反應(yīng)是有利于細(xì)菌感染和存活的？哪些反應(yīng)對MTB控制不起作用的？對這些問題的了解還是非常不足的。

在以往結(jié)核病新疫苗的研發(fā)過程中，對于免疫原的來源，多數(shù)是基于早期對MTB培養(yǎng)基過濾物中分離蛋白成分的遴選。對于能夠引起宿主免疫反應(yīng)的蛋白，往往傾注了非常多的希望和努力。然而在經(jīng)過長期的研究和評價后，對于結(jié)核病保護(hù)性免疫反應(yīng)的特點(diǎn)，仍然沒有太多的理解和認(rèn)識。因此，要想確切地站在科學(xué)的角度理解和推進(jìn)結(jié)核病新疫苗的研發(fā)，就必然需要應(yīng)用可以準(zhǔn)確控制的動物實(shí)驗研究，系統(tǒng)地分析結(jié)核病的免疫反應(yīng)特點(diǎn)和類型，進(jìn)而從中發(fā)掘?qū)Y(jié)核病保護(hù)性免疫反應(yīng)的特征特點(diǎn)。

二、結(jié)核病免疫學(xué)研究難度大

(一)MTB復(fù)雜的生物學(xué)特性

1. 基因組龐大。隨著第一個分枝桿菌菌株(實(shí)驗室菌株H37Rv)全基因組序列的完成，讓我們真正能夠從遺傳構(gòu)成上開始了解和認(rèn)識導(dǎo)致結(jié)核病的致病菌[7]。H37Rv基因組由4 411 532個堿基組成，G+C含量為65.6%，4043個基因編碼了3993個蛋白和50個RNA。在隨后其他各種菌株測序結(jié)果陸續(xù)完成后，包括基于基因組序列對MTB和BCG比較，讓我們更加認(rèn)識到僅僅獲得基因組序列對認(rèn)識結(jié)核病的發(fā)病機(jī)理還是遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠的。復(fù)雜的遺傳組成帶來復(fù)雜的致病機(jī)理。

2. 生長緩慢。在結(jié)核病的研究中，令人極為困惑的一個問題就是“為什么MTB的生長速度非常緩慢”。這除了在臨床診斷上會帶來不同于其他細(xì)菌的特別問題外，在藥物治療和科學(xué)研究中都成為需要特別關(guān)注的問題。痰液中分離的菌株在固體培養(yǎng)基上生長需要2～4周的時間，而從動物組織中培養(yǎng)分離菌株需要4周左右的時間。這導(dǎo)致對MTB的研究需要超出其他研究較多的時間和準(zhǔn)備工作。

(二)動物實(shí)驗條件要求高

1. 生物安全。研究病原菌致病機(jī)理的工作是離不開動物模型的，而進(jìn)行結(jié)核病動物模型實(shí)驗需要在生物安全三級實(shí)驗室(BSL3)進(jìn)行。由于結(jié)核病動物實(shí)驗研究的核心問題是潛伏感染和潛伏感染復(fù)發(fā)，所以從細(xì)菌感染動物直到被感染動物進(jìn)入穩(wěn)定的潛伏感染狀態(tài)，需要足夠長的時間才能實(shí)現(xiàn)(如小鼠，感染4～6個月后進(jìn)入穩(wěn)定的潛伏感染狀態(tài))。所以，相關(guān)研究從實(shí)驗室運(yùn)行成本、實(shí)驗技術(shù)內(nèi)容及實(shí)驗條件要求等都是很高的。而對于結(jié)核病發(fā)病機(jī)理的研究，以及基于這些動物研究的新藥物研發(fā)評價和疫苗研發(fā)評價，都必須有成熟可靠的動物實(shí)驗支撐才能進(jìn)行。

2. 經(jīng)濟(jì)成本。BSL3日常運(yùn)行費(fèi)用、動物管理實(shí)驗費(fèi)用，尤其是帶菌狀態(tài)活體動物的管理，決定了結(jié)核病的動物模型實(shí)驗成本比較高。尤其是在使用特定遺傳特性小鼠品系，使用一定數(shù)量的豚鼠，或是使用非人靈長動物進(jìn)行研究時，這些實(shí)驗的難度和物資消耗成本較一般的動物實(shí)驗高。

3. 研究技能培訓(xùn)時間。現(xiàn)代結(jié)核病免疫機(jī)理的研究，是一個集合了分子生物學(xué)、免疫學(xué)、細(xì)胞學(xué)、分子遺傳學(xué)、生物化學(xué)、生物物理學(xué)、結(jié)構(gòu)生物學(xué)、生物信息學(xué)等多種學(xué)科技術(shù)方法并不斷成熟和發(fā)展的研究體系。在成熟的結(jié)核病動物實(shí)驗技能培訓(xùn)中，對于科研人員必須掌握相關(guān)技能的訓(xùn)練和培養(yǎng)往往需要通過6個月以上的時間，才能完成對一個可獨(dú)立從事結(jié)核病動物實(shí)驗人員生物安全操作技能的培訓(xùn)。

(三)動物實(shí)驗的周期長

1. 潛伏感染是重點(diǎn)。結(jié)核病的特點(diǎn)是潛伏感染和潛伏感染復(fù)發(fā)，因此結(jié)核病免疫機(jī)理的研究首先就是潛伏感染形成的機(jī)理和特點(diǎn)。相對而言，結(jié)核病動物模型研究的重點(diǎn)，是在確定細(xì)菌成功感染的基礎(chǔ)上進(jìn)入潛伏感染的狀態(tài)。所有能夠影響感染成功、能夠影響進(jìn)入潛伏感染狀態(tài)、能夠成功保持潛伏感染狀態(tài)的現(xiàn)象和條件都是研究的重要領(lǐng)域和方向[8]。

2. 潛伏感染復(fù)發(fā)控制。這是造成臨床實(shí)踐中結(jié)核病發(fā)生發(fā)展復(fù)雜性的根本原因。在可以明確發(fā)病的情況下，應(yīng)對的手段和方式也是可以明確的。對于攜帶MTB的潛伏感染者，究竟其在什么樣的條件下會發(fā)生結(jié)核病？發(fā)生結(jié)核病的原因和特征是什么？這些仍然有待深入研究解決的問題，使得控制結(jié)核病這樣一個呼吸道傳播的傳染病變得極其復(fù)雜和困難。在動物模型的研究中，就是要在可控條件下，充分研究造成潛伏感染復(fù)發(fā)的條件和方法，深入理解認(rèn)識其復(fù)發(fā)的原因機(jī)理，從而為結(jié)核病臨床的早期診斷技術(shù)、免疫控制技術(shù)和疫苗的研究開發(fā)，提供系統(tǒng)的數(shù)據(jù)支持[9-10]。

(四)感染免疫反應(yīng)的復(fù)雜生物學(xué)基礎(chǔ)

1. 細(xì)菌的遺傳特性。在基因組構(gòu)成上，通過對MTB臨床菌株CDC1551全基因組序列的分析，可以發(fā)現(xiàn)CDC1551與H37Rv在86個位點(diǎn)上有超過10個堿基的插入或缺失，有1075個點(diǎn)突變[11]。牛分枝桿菌基因組序列與MTB同源性高達(dá)99.95%，但其基因組較人的小約60 kB[12]；BCG菌株的基因組序列分析顯示，較MTB和BCG菌株的基因組染色體至少有18個大的片段是缺失的，約包括120個基因[13]。

2. 宿主的遺傳特性。多樣性是自然界生物進(jìn)化的必然結(jié)果。在病原與宿主的感染抵抗過程中，其中由于宿主遺傳因素帶來的免疫反應(yīng)差異，是決定MTB與宿主互作過程中是否發(fā)病至關(guān)重要的因素。然而到目前為止，人類對結(jié)核病相關(guān)宿主遺傳因素的了解仍然是初步且是非常有限的[14]。進(jìn)一步深入研究人的遺傳基因變異在結(jié)核病發(fā)病過程的作用，對于結(jié)核病疫苗研發(fā)和臨床治療技術(shù)的提高，對于臨床結(jié)核病治療和預(yù)防效果的改善都會產(chǎn)生重要影響[15]。

(五)MTB感染、致病、毒力研究技術(shù)

1. 發(fā)現(xiàn)遺傳學(xué)上的因果關(guān)系。這是當(dāng)代創(chuàng)新藥物和疫苗研發(fā)的關(guān)鍵所在。我們已經(jīng)觀察到MTB能夠引發(fā)宿主非常強(qiáng)烈和復(fù)雜的免疫反應(yīng)，但是對于這些免疫反應(yīng)各自的生物學(xué)功能和意義的認(rèn)識卻仍然處在很原始的階段。隨著MTB基因組測序工作的完成，我們有機(jī)會在遺傳控制的層面詳細(xì)而全面地對MTB每一個基因在細(xì)菌生物學(xué)功能、致病過程的作用，以及其作用的分子機(jī)理進(jìn)行分析研究，從而深入了解MTB基因組中每個基因在結(jié)核病發(fā)生過程中所起的作用和作用方式是什么。一旦落實(shí)了感染與致病間的因果關(guān)系，對于結(jié)核病的治療和控制也就到了要發(fā)生突破的地步了。

以這樣一種前所未有的新技術(shù)高度對結(jié)核病免疫機(jī)理進(jìn)行全面的研究，是因為支持這種研究所需要的系列技術(shù)手段已經(jīng)得到了突破。這里有3個關(guān)鍵的技術(shù)：第一是MTB全基因組測序完成，這樣就允許我們針對其基因組的構(gòu)成進(jìn)行相關(guān)的基因工程操作；第二是MTB基因敲除技術(shù)的成熟，通過定向構(gòu)建特定基因敲除的突變體，就允許我們對目的基因的生物和病原學(xué)功能進(jìn)行一對一的針對性研究；第三是可以較好模擬人結(jié)核病特點(diǎn)的慢性結(jié)核病動物模型。

同任何重要生物學(xué)研究和疾病研究的過程一樣，對結(jié)核病的研究也是在通過對臨床大量疾病現(xiàn)象的觀察開始的。在遺傳學(xué)技術(shù)不夠成熟的情況下，主要是通過對各種現(xiàn)象進(jìn)行觀察和統(tǒng)計分析，確定疾病的各種客觀性狀反應(yīng)。而在具備了不斷完善成熟的分子、免疫和遺傳學(xué)技術(shù)方法后，借助這些技術(shù)方法對造成結(jié)核病各種病理性狀的機(jī)理進(jìn)行更加深入的研究，將成為今后進(jìn)一步提高對結(jié)核病診斷、治療、藥物和疫苗研究水平和能力的必然趨勢。

2. 細(xì)菌基因影響的宿主免疫反應(yīng)。正如早期致病菌研究中普遍發(fā)生的現(xiàn)象那樣，對于能夠在培養(yǎng)條件下分泌到培養(yǎng)基中的細(xì)菌蛋白等產(chǎn)物，自然會引起研究人員的興趣，這些產(chǎn)物也就是最早跟隨生物化學(xué)等技術(shù)手段的發(fā)展而被重點(diǎn)研究的對象。但是隨著相關(guān)領(lǐng)域技術(shù)和研究的不斷積累和發(fā)展，對這些問題的理解就有了更加深入的認(rèn)識和提高。比如，這些體外培養(yǎng)狀態(tài)的分泌物，在細(xì)菌感染宿主細(xì)胞時是否一定會分泌到環(huán)境中去？這些進(jìn)入宿主細(xì)胞的MTB如何將分泌到細(xì)胞中的產(chǎn)物遞送到宿主細(xì)胞外的？這些被用來影響宿主免疫反應(yīng)的產(chǎn)物都是由細(xì)菌中哪些基因控制的？其基因控制的分子機(jī)理是什么？

在MTB免疫反應(yīng)的研究中，除了其編碼的蛋白質(zhì)外，在MTB細(xì)胞中含量特別豐富的糖類和脂類產(chǎn)物，也是非常重要的研究對象。然而由于技術(shù)上對這些物質(zhì)的分離提純難度大，使得對于其相應(yīng)的生物和病理研究也就相對較少。近年來，隨著MTB遺傳操作技術(shù)的發(fā)展，通過對糖類和脂類產(chǎn)物生物合成及代謝基因的敲除，研究者有了對這些生化物質(zhì)的代謝機(jī)理和意義進(jìn)行深入研究的機(jī)會，同時也能夠?qū)@些產(chǎn)物在結(jié)核病發(fā)生過程中的作用及作用原理進(jìn)行深入的研究[16]。

由于我們已經(jīng)知道了MTB全部的遺傳構(gòu)成，已經(jīng)掌握了對其基因進(jìn)行遺傳操作的技術(shù)和能力，在這樣的技術(shù)條件下，不僅可以對MTB作為一個普通微生物進(jìn)行生物特性調(diào)控規(guī)律的分子機(jī)理研究，也可以在感染宿主的過程中對其致病、潛伏和復(fù)發(fā)的病理特性調(diào)控規(guī)律的分子機(jī)理進(jìn)行系統(tǒng)的研究。落實(shí)到宿主的免疫狀態(tài)上，借助于病原菌基因敲除的突變體技術(shù)，就可以對病原菌的基因功能及其代謝調(diào)控是如何影響宿主免疫反應(yīng)的分子機(jī)理進(jìn)行深入的研究。

3. 細(xì)菌多基因影響的宿主復(fù)雜免疫反應(yīng)。MTB是一種非常成功的致病菌，其龐大的基因組構(gòu)成也決定了其對宿主侵襲過程的復(fù)雜性。在特定病理毒力性狀形成的過程中，在長期進(jìn)化過程中，往往會形成一系列的功能補(bǔ)償機(jī)制，即一個特定性狀的形成和維持往往是需要多個基因協(xié)同作用產(chǎn)生的結(jié)果。

在以往針對MTB相關(guān)復(fù)雜性狀的研究中，由于無法進(jìn)行多基因敲除突變體的構(gòu)建，我們也就無法對這些復(fù)雜性狀發(fā)生的機(jī)理進(jìn)行全面深入的研究。當(dāng)技術(shù)發(fā)展到可以構(gòu)建多基因敲除突變體時，針對MTB生物學(xué)功能和致病能力的研究即可進(jìn)入到一個非常令人激動的階段。這樣我們不但可以對由單基因決定的相對簡單的性狀機(jī)理進(jìn)行研究，還可以對由多個基因協(xié)同作用的復(fù)雜性狀進(jìn)行研究，這對于深入理解結(jié)核病的發(fā)生發(fā)展機(jī)理，尤其是對于深入研究宿主免疫調(diào)控的機(jī)理和方法都是一個重大的機(jī)會。

三、結(jié)核病免疫學(xué)系統(tǒng)研究條件的成熟

(一)MTB突變體的構(gòu)建和選擇

A. 操作技術(shù)流程。B. 突變體構(gòu)建示例：(1)獲得目的基因(如pncA)上下游+1000 bp的DNA序列；(2)分別設(shè)計上游(LFS)和下游(RFS)PCR擴(kuò)增的引物序列；(3)將LFS和RFS序列分別克隆到穿梭質(zhì)粒上；(4)完成基因敲除后，細(xì)菌基因組中原pncA的編碼區(qū)將被載體上的抗生素選擇標(biāo)志基因(Hyg，即潮霉素)序列替換

1. 突變體文庫。結(jié)核病分子水平的科學(xué)研究需要分子水平的技術(shù)手段才能夠進(jìn)行。當(dāng)具備了MTB全基因組序列、MTB基因敲除及MTB多重基因敲除的技術(shù)之后，對MTB基因組中每一個基因在其生物學(xué)功能和病理學(xué)功能中的作用進(jìn)行研究，都成為結(jié)核病致病機(jī)理研究不可或缺的工作。而構(gòu)建突變體文庫，也就是構(gòu)建全部每個基因都單獨(dú)敲除的突變體細(xì)菌，就成為MTB致病機(jī)理研究中前所未有的強(qiáng)大工具，就成為我們?nèi)娣治鲅芯拷Y(jié)核病分子免疫機(jī)理最重要的科學(xué)技術(shù)基礎(chǔ)。構(gòu)建MTB基因敲除突變體的操作技術(shù)流程和示例見圖1。

2. 可借鑒類比的基因。所有的研究都是從每一個具體的編碼基因開始的。在一個具體的研究工作中，究竟挑選哪一個基因進(jìn)行研究，這是每位科研人員必然要進(jìn)行選擇的。一般的選擇方式，是通過其他比較詳細(xì)的微生物的研究，或從其他領(lǐng)域前人的研究結(jié)果中尋找類似功能過程的控制基因，再開始進(jìn)行自己在MTB致病性中的研究。這種方法就是通過借鑒類比的方法，來選擇自己個人傾向性的研究對象。這樣選擇的優(yōu)點(diǎn)是：相應(yīng)的實(shí)驗走向預(yù)期有直接的類比參考，實(shí)驗的路線和具體技術(shù)內(nèi)容相對容易選擇和預(yù)期。

3. 有突出興趣分析的基因。這是一種具有強(qiáng)烈個人興趣的研究選擇。有的人對耐藥特性有興趣，所以會首先選擇耐藥的相關(guān)基因進(jìn)行研究；有些人對細(xì)菌基因表達(dá)調(diào)控的分子機(jī)制有興趣，所以會選擇一些轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子的編碼基因進(jìn)行研究；有些人對細(xì)菌細(xì)胞壁的特殊組成有興趣，所以會選擇與糖類和脂類合成代謝有關(guān)的基因進(jìn)行研究。在這樣不同的基因功能的研究中，即便我們對選定的基因功能有了預(yù)期和希望，但在完成實(shí)驗得到具體客觀研究數(shù)據(jù)之前，經(jīng)常會有令人意外和驚喜的新發(fā)現(xiàn)。

4. 功能全新或功能未知的基因。對這些基因功能的研究往往挑戰(zhàn)比較大，因為前期可參考的工作比較少，每一步的研究都可能會有很大的意外結(jié)果。對于MTB這種致病能力非常特別的病原菌來講，在與宿主相互作用中有特別的病理表現(xiàn)，如胞內(nèi)寄生、潛伏感染、潛伏感染的復(fù)發(fā)等，對這些復(fù)雜的關(guān)鍵性問題的解答也就使得對功能未知的基因或是已知基因的未知功能的研究成為非常令人向往的研究工作。

MTB基因敲除技術(shù)的發(fā)展和成熟，促使我們可以對MTB所有編碼基因在結(jié)核病發(fā)生中的作用進(jìn)行研究和分析。在此基礎(chǔ)上，結(jié)核病免疫機(jī)理研究和結(jié)核病有效控制技術(shù)也可達(dá)到一個全新的高度。以往只能在觀察基礎(chǔ)上進(jìn)行統(tǒng)計和猜測，現(xiàn)在就有可能通過分子遺傳學(xué)研究的技術(shù)，進(jìn)一步將研究推進(jìn)到相關(guān)性狀的因果關(guān)系的分子功能機(jī)制水平上。在這樣的形勢下，結(jié)核病領(lǐng)域中科研人員是否普遍掌握和熟練應(yīng)用MTB分子遺傳學(xué)研究技術(shù)，已經(jīng)成為當(dāng)前全球結(jié)核病研究領(lǐng)域研究能力高低評判的客觀標(biāo)準(zhǔn)。

(二)結(jié)核病研究實(shí)驗動物模型的成熟

1. 小鼠模型。這個模型是最成熟最普遍的結(jié)核病研究模型。其優(yōu)點(diǎn)是：第一，實(shí)驗成本低，容易操作，可以進(jìn)行具有足夠數(shù)量動物的研究，在結(jié)核病免疫研究和藥物及疫苗篩選中具有重要價值；第二，小鼠種系遺傳背景清晰，是可以非常穩(wěn)定重復(fù)和應(yīng)用的結(jié)核病研究模型；第三，已有的結(jié)核病動物免疫機(jī)理研究，幾乎全部都是通過小鼠結(jié)核病模型研究獲得的成果。小鼠模型不足之處是其結(jié)核病理過程與人結(jié)核病差異較大，比如低劑量潛伏感染模型中肺部細(xì)菌載量很高，小鼠結(jié)核肉芽腫與人結(jié)核肉芽腫結(jié)構(gòu)差異很大，尚不能完全模擬人的結(jié)核病特點(diǎn)[17]。

2. 豚鼠模型。這是最早在結(jié)核病研究中用到的動物模型，其肉芽腫組織與人的結(jié)核病肉芽腫組織很像，如出現(xiàn)組織壞死以及形成多核巨大細(xì)胞等。這個模型是結(jié)核病疫苗和新藥物效果評價非常重要的技術(shù)手段。豚鼠模型的局限性主要包括實(shí)驗成本比較高，另外豚鼠研究所需的相關(guān)免疫實(shí)驗試劑比較少，所以除了對疫苗和藥品效果的評價研究外，真正基于豚鼠模型對結(jié)核病免疫機(jī)理的研究仍然非常有限。

3. 非人靈長動物(猴子)模型。雖然這樣的模型非常昂貴，但由于這是所有結(jié)核病研究動物模型中最接近人的動物研究，所以基于猴子的結(jié)核病研究仍然是非常迫切和重要的。在結(jié)核病藥物和疫苗研發(fā)評價中，猴子模型的工作是必須進(jìn)行的，因此近10年來這個模型的結(jié)核病研究工作發(fā)展非常快。結(jié)核病猴子模型的主要局限性：一是價格昂貴，二是生物安全控制難度大，三是個體間遺傳差異大。雖然其研究的免疫試劑類型比豚鼠要多，但在進(jìn)行全面免疫實(shí)驗研究分析中，可用的實(shí)驗試劑仍然有待填補(bǔ)充實(shí)[18](圖2)。

四、結(jié)核病比較免疫學(xué)的形成

(一)臨床疫苗和藥物研發(fā)必須的實(shí)驗過程

簡單卻又必須明確認(rèn)識的一個問題，就是結(jié)核病是嚴(yán)重危害人類健康的傳染病。在缺乏有效的新型疫苗，缺乏廣泛可選的治療藥品，缺乏對潛伏感染復(fù)發(fā)診斷有效評價診斷技術(shù)的情況下，對人結(jié)核病發(fā)生發(fā)展過程中的免疫機(jī)理研究，是最終實(shí)現(xiàn)人類終止結(jié)核病目標(biāo)無可回避的必然選擇。在沒有任何可能用人來進(jìn)行MTB感染系統(tǒng)實(shí)驗研究的情況下，要想做到這一點(diǎn)，就必須借助動物模型的研究來幫助認(rèn)識臨床結(jié)核病的發(fā)病機(jī)理。

同時，這也是由臨床結(jié)核病治療藥物和疫苗研發(fā)必須的技術(shù)過程所要求和決定的。在最常用到的3個結(jié)核病動物模型中，每個模型都有著各自的優(yōu)點(diǎn)和缺點(diǎn)。在當(dāng)前階段下，一個是為滿足臨床藥物和疫苗評價研究的需要，一個是充分研究不同宿主結(jié)核病發(fā)病特征機(jī)理研究的需要，小鼠、豚鼠和猴子結(jié)核病模型都是必然需要的，是不能缺少的。

(二)不同宿主類型結(jié)核病免疫反應(yīng)的異同

對于小鼠、豚鼠和猴子被MTB感染和發(fā)病確切的免疫反應(yīng)過程的認(rèn)識仍然是比較粗淺的，比如在這3種動物結(jié)核病發(fā)病過程中，其各自總體的免疫反應(yīng)究竟都有哪些不同？這些不同的免疫反應(yīng)的生理功能究竟是什么？這些免疫反應(yīng)的病理意義又是什么？什么樣的免疫反應(yīng)是宿主的保護(hù)性免疫反應(yīng)？由于這些基礎(chǔ)的研究和數(shù)據(jù)非常有限，所以難以滿足我們對結(jié)核病發(fā)病機(jī)理認(rèn)識的需要。

(三)結(jié)核病相關(guān)保護(hù)性免疫反應(yīng)的研究認(rèn)識

在結(jié)核病免疫反應(yīng)的研究中，一個特別迫切需要并希望能夠有所進(jìn)展的，就是不同動物間結(jié)核病的保護(hù)性免疫反應(yīng)是否相同？不同動物各自的保護(hù)性免疫反應(yīng)分別是什么？如何將結(jié)核病臨床檢測觀察的數(shù)據(jù)對應(yīng)到基于結(jié)核病動物模型的研究數(shù)據(jù)中？這樣的數(shù)據(jù)和結(jié)果對于結(jié)核病新藥物研發(fā)和疫苗研發(fā)都是極其寶貴和重要的。借助于這些動物模型進(jìn)行翔實(shí)而系統(tǒng)的實(shí)驗研究，人類對結(jié)核病的發(fā)生發(fā)展機(jī)理就會真正有了質(zhì)的飛躍，對于研發(fā)臨床結(jié)核病有效新藥物和疫苗的評價分析就會更加可靠和有目的性。

A. 結(jié)核病動物模型技術(shù)。B. MTB基因敲除技術(shù)

(四)研究數(shù)據(jù)積累豐富后的必然結(jié)果

在無法評價宿主有效免疫反應(yīng)特點(diǎn)的情況下，通過不同動物模型進(jìn)行的結(jié)核病研究依然處于數(shù)據(jù)積累和觀察的階段。另一方面，基于小鼠、豚鼠、猴子的不同物種遺傳背景的系統(tǒng)研究，為進(jìn)一步的研究創(chuàng)造了一個重要的機(jī)會，即對不同基因敲除的MTB突變體在感染不同生物宿主時，其對宿主的免疫反應(yīng)調(diào)控結(jié)果是什么。伴隨著這些研究的深入開展和數(shù)據(jù)積累，人類對于結(jié)核病的發(fā)病機(jī)理和疾病可能的控制技術(shù)研究，也就到了一個全新的階段和時刻。這個時段的認(rèn)識既包含不同免疫遺傳構(gòu)成下宿主應(yīng)對MTB感染的免疫調(diào)控反應(yīng)，也包括不同基因缺失突變后MTB對宿主免疫反應(yīng)的影響。

(五)發(fā)掘結(jié)核病臨床數(shù)據(jù)價值的技術(shù)框架需要

雖然結(jié)核病的動物模型不能完全模擬人的結(jié)核病發(fā)病過程，但利用MTB突變體文庫進(jìn)行系統(tǒng)的研究卻是必須的，也是只能在動物模型上才可以進(jìn)行的。我國擁有龐大的MTB感染人群，通過結(jié)核病患者、MTB潛伏感染者、未感染者臨床樣本的收集和分析，可以獲得豐富的MTB感染免疫反應(yīng)的臨床資料和數(shù)據(jù)。這樣的臨床資料和數(shù)據(jù)，再結(jié)合通過3種結(jié)核病動物模型的精確研究獲得的系統(tǒng)而豐富的科學(xué)數(shù)據(jù)，使人們有機(jī)會獲得不同類型個體間結(jié)核病保護(hù)性免疫反應(yīng)的認(rèn)識，從而為臨床上結(jié)核病的精確診斷、治療和預(yù)防提供前所未有的機(jī)會和工具。

(六)打開宿主免疫調(diào)控研究的大門

無論是各種腫瘤和自體免疫性疾病治療中的抗體藥物，還是各種免疫調(diào)節(jié)治療使用的佐劑類藥物，都是利用對宿主免疫調(diào)控的干預(yù)來實(shí)現(xiàn)臨床治療的目的。從廣義的角度上講，免疫調(diào)控對于疾病的治療和疫苗的使用都是技術(shù)手段的核心。由于MTB天然的免疫調(diào)控能力，可以引發(fā)復(fù)雜而強(qiáng)烈的宿主免疫反應(yīng)，在研究厘清其在結(jié)核病控制中的作用和意義的同時，結(jié)核病免疫機(jī)理的深入研究也正為今后宿主免疫調(diào)控技術(shù)和產(chǎn)品的研發(fā)利用提供了一個非常特別的歷史性機(jī)遇。

一方面，通過對小鼠、豚鼠、猴子、人類結(jié)核感染和結(jié)核病免疫反應(yīng)及其調(diào)控機(jī)理的研究，將會充分理解認(rèn)識在不同遺傳組成和背景下，不同免疫反應(yīng)調(diào)控類型的生物學(xué)機(jī)理是什么。另一方面，對其他不同類型疾病免疫調(diào)控變化進(jìn)行研究分析，將其與結(jié)核病相關(guān)過程中免疫調(diào)控特點(diǎn)進(jìn)行比較，進(jìn)一步理解宿主特定免疫調(diào)控過程在疾病或健康維持過程中的免疫學(xué)意義。再一方面，就是通過借鑒結(jié)核免疫調(diào)控機(jī)理的原理，對包括結(jié)核病及更多類型其他疾病的保護(hù)性免疫反應(yīng)進(jìn)行認(rèn)識和研究，從而為更加深刻全面理解認(rèn)識宿主免疫調(diào)控分子機(jī)理，并加以利用發(fā)展為新的疾病預(yù)防、診斷、治療和研究的技術(shù)產(chǎn)品資源。

五、基于細(xì)菌基因功能分析的結(jié)核病免疫學(xué)研究技術(shù)路線

雖然針對每個基因功能及其在宿主免疫反應(yīng)中的影響，具體的研究技術(shù)路線會有不同，但就具體實(shí)驗研究過程來講，基于MTB基因突變技術(shù)和動物模型相關(guān)研究的核心技術(shù)路線是基本一致的。從當(dāng)前結(jié)核病領(lǐng)域核心研究技術(shù)的發(fā)展需要和成果遞進(jìn)情況來講，結(jié)核病比較免疫學(xué)的核心技術(shù)過程包括以下幾個方面的主要內(nèi)容。

(一)野生型和突變體的平行實(shí)驗

1. 對照的價值。在結(jié)核病免疫機(jī)理的動物模型研究中，在標(biāo)準(zhǔn)的衛(wèi)生環(huán)境條件下，利用遺傳組成穩(wěn)定的動物宿主和單克隆化的標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗室MTB菌株(H37Rv和Erdman)，建立可穩(wěn)定重復(fù)的結(jié)核病發(fā)病過程模擬，這就是結(jié)核病研究的動物實(shí)驗?zāi)Ｐ汀Ｆ渲型ㄟ^大量長期實(shí)驗研究積累的野生型MTB感染宿主導(dǎo)致的宿主結(jié)核病病理反應(yīng)，就是標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗條件下該動物模型中結(jié)核病的典型表現(xiàn)性狀。有了這樣的成熟動物模型條件，對MTB基因在侵襲宿主時決定和參與影響的免疫反應(yīng)機(jī)理的研究，才真正具備了可靠的模型實(shí)驗條件。

在所有針對特定基因敲除突變體的動物實(shí)驗研究中，野生型菌株的對照實(shí)驗始終都是必不可少的。用野生型的MTB感染動物，目的就是獲得在正常MTB感染及發(fā)病過程中，宿主穩(wěn)定的標(biāo)準(zhǔn)免疫反應(yīng)。野生型MTB在每個獨(dú)立實(shí)驗中的作用，一方面，這是對所有實(shí)驗操作過程質(zhì)量可靠性的評價方式；另一方面，這是不同研究人員各自獨(dú)立的實(shí)驗結(jié)果數(shù)據(jù)可比性分析的基礎(chǔ)；再有一方面，這更是構(gòu)建完整結(jié)核病免疫反應(yīng)調(diào)控數(shù)據(jù)體系必須的質(zhì)量控制基礎(chǔ)[19-20]。

2. 研究數(shù)據(jù)的可信度。結(jié)核病科學(xué)實(shí)驗研究中，首先需要保證的是目的研究變量必須是唯一的。日常生活中，很多人習(xí)慣將諸多變量投入到一個問題的討論中，甚至同時將2個以上的變量放在一起進(jìn)行所謂的“研究”，這種雙重不確定性的討論在實(shí)驗科學(xué)中是必須排除的。所以在精確的MTB基因功能分析中，一個必須明確的原則就是針對這個基因功能的研究必須是建立在對這一個基因進(jìn)行敲除的突變基礎(chǔ)上。當(dāng)將這樣的目的基因特異敲除形成突變體后，與野生型菌株相比較，突變體菌株只是缺少了這個被研究的目的基因，而其他所有遺傳組成與野生型菌株是完全相同的。這樣，在隨后實(shí)驗中所觀察到的所有性狀改變，才可能是這個被敲除基因所帶來的結(jié)果。

有了野生型菌株的實(shí)驗作為對照，通過對野生型菌株感染動物形成的結(jié)核免疫反應(yīng)的穩(wěn)定與否，首先可以判斷的就是這個實(shí)驗操作是否正確可靠。在此基礎(chǔ)上，作為目的基因突變的菌株感染所引發(fā)的宿主免疫變化，才可能是真正客觀的宿主免疫調(diào)控能力的變化。

3. 突變體回補(bǔ)。早期的研究中，能夠獲得基因突變的菌株已經(jīng)是很不容易的工作了。但是實(shí)驗中僅有基因敲除的突變體數(shù)據(jù)并不能完全保證觀察到的現(xiàn)象完全是由這個基因敲除所導(dǎo)致的，因為在類似MTB這樣的原核生物中，線性排列的基因之間往往相隔不遠(yuǎn)，有些基因的編碼區(qū)域甚至是相互重疊的，這就存在著一種可能，即當(dāng)我們敲除某個特定基因的時候，實(shí)際上與之相鄰的另外一個基因的功能也受到了影響，從而導(dǎo)致在動物感染實(shí)驗中觀察到的性狀改變是由這個相鄰基因功能的變化所導(dǎo)致的。

所以在基因敲除突變體的研究分析中，同時還必須構(gòu)建另外一個菌株，即把被敲除的基因克隆在一個MTB的質(zhì)粒表達(dá)載體上，重新轉(zhuǎn)回到該基因敲除的突變體中，使得這個原有位點(diǎn)缺失的基因又被補(bǔ)回到細(xì)菌當(dāng)中。當(dāng)這個突變體回補(bǔ)菌株的動物實(shí)驗數(shù)據(jù)與野生型菌株動物數(shù)據(jù)一致或基本一致的時候，也就完全證明在突變體菌株動物實(shí)驗中所看到的性狀變化就是由于這個基因的缺失所導(dǎo)致的。這樣也就從實(shí)驗上證明了這個被研究的目的基因在結(jié)核病發(fā)病過程中的作用[21]。

(二)標(biāo)準(zhǔn)的動物模型

1. 感染方式。以呼吸道感染的方式接種MTB，這是最理想的結(jié)核病動物模型的細(xì)菌接種方式。這樣的模型因為在感染的方式上最大程度地模擬了MTB的自然感染過程，所以在宿主的發(fā)病過程中所產(chǎn)生的相關(guān)免疫反應(yīng)也與結(jié)核病自然發(fā)生發(fā)展的過程最接近。目前通過呼吸道氣溶膠方式感染小鼠和豚鼠的動物模型已經(jīng)非常成熟，而猴子則主要是通過氣管鏡接種的方式進(jìn)行[22-23]。

2. 感染劑量。在呼吸道感染的結(jié)核病動物模型中，感染劑量的控制是核心技術(shù)參數(shù)。在高劑量MTB的感染中，宿主(動物)往往由于無法有效控制細(xì)菌的感染，一經(jīng)感染即會發(fā)生嚴(yán)重的疾病甚至死亡。這樣的感染和發(fā)病方式由于無法形成穩(wěn)定的潛伏感染狀態(tài)，因此也就無法成為可以替代臨床癥狀進(jìn)行系統(tǒng)免疫機(jī)理研究的結(jié)核病動物模型。

低劑量感染模型是當(dāng)前結(jié)核病動物模型研究的通用模型。在小鼠結(jié)核病動物模型中，當(dāng)呼吸道接種菌株數(shù)為個位數(shù)的情況下，就可以形成穩(wěn)定而標(biāo)準(zhǔn)的慢性結(jié)核病發(fā)病模型。同時由于低的感染菌株量能夠更加真實(shí)地反映自然界中MTB初始感染的特點(diǎn)，所以低劑量感染的動物模型是當(dāng)前各種結(jié)核病動物模型研究中普遍采用的研究方式。

3. 潛伏感染。由于MTB是一種胞內(nèi)菌，在其成功感染宿主細(xì)胞后，最常見的情況是MTB以一種被局限約束的非活躍狀態(tài)存在，被宿主免疫系統(tǒng)有效地控制住，這就是MTB感染中非常特別的潛伏感染，即帶菌而不發(fā)病。對于潛伏感染的人群來講，在宿主正常健康狀態(tài)下體內(nèi)的MTB是不會引起宿主發(fā)生結(jié)核病的。在結(jié)核病的動物模型研究中，建立體內(nèi)能夠攜帶細(xì)菌長期存在而又不會發(fā)生活動性結(jié)核病的模型，就是典型而理想的結(jié)核病潛伏感染模型。對于結(jié)核病免疫控制機(jī)理的研究而言，早期的工作主要是進(jìn)行建立這種理想的結(jié)核病實(shí)驗動物模型的研究[24-25]。

4. 潛伏感染的復(fù)發(fā)。在臨床患者中，絕大多數(shù)的結(jié)核病患者是從潛伏感染狀態(tài)轉(zhuǎn)化成為活動性結(jié)核病發(fā)病狀態(tài)的，因此對于成功的結(jié)核病動物模型來講，能夠進(jìn)入潛伏感染狀態(tài)，并且能夠可控制地由潛伏感染狀態(tài)進(jìn)入活動性結(jié)核病發(fā)病狀態(tài)，決定了這個動物模型在結(jié)核病研究中的實(shí)際應(yīng)用價值和意義。在當(dāng)前采用的慢性結(jié)核病動物模型中，小鼠模型在潛伏感染復(fù)發(fā)研究中是最成熟的，雖然這個模型的病理過程與人結(jié)核病病理有很大的差別，但目前關(guān)于結(jié)核病潛伏感染和潛伏感染復(fù)發(fā)免疫機(jī)理的認(rèn)識，絕大多數(shù)都是通過小鼠慢性結(jié)核病模型的實(shí)驗研究獲得的。而豚鼠和猴子慢性結(jié)核病復(fù)發(fā)的模型構(gòu)建工作也在進(jìn)一步的完善過程中[10，26-27]。

(三)動物實(shí)驗研究的重要數(shù)據(jù)內(nèi)容

下文以小鼠動物實(shí)驗為例，對在比較免疫機(jī)理的研究和數(shù)據(jù)體系中，標(biāo)準(zhǔn)的結(jié)核病動物實(shí)驗需要收集和觀察的關(guān)鍵研究數(shù)據(jù)進(jìn)行解釋。

1. 感染劑量和組織的細(xì)菌載量。這是所有結(jié)核病動物模型研究的一個基本的標(biāo)準(zhǔn)性數(shù)據(jù)。一般在呼吸道接種的“零日”，也就是接種后的第一天，通過對細(xì)菌感染后的實(shí)驗動物組織感染細(xì)菌的數(shù)量進(jìn)行確定，這是感染劑量。再一個是在確定的時間點(diǎn)對感染的動物組織細(xì)菌的數(shù)量進(jìn)行確定，這就是這個感染時間點(diǎn)細(xì)菌的組織載量。

具體的操作過程就是對相應(yīng)數(shù)量感染小鼠的肺、脾、肝進(jìn)行組織研磨，進(jìn)行系列稀釋后涂抹于培養(yǎng)基上，經(jīng)過4周溫箱培養(yǎng)后，通過培養(yǎng)皿上細(xì)菌的數(shù)量確定其接種感染的最初菌量是多少，確定每個時間點(diǎn)組織中細(xì)菌載量是多少。被感染動物的組織細(xì)菌載量是結(jié)核病病理分析和實(shí)驗過程質(zhì)量控制最根本，也是最準(zhǔn)確的評判標(biāo)準(zhǔn)[28]。

2. 感染的組織病理。除了對實(shí)驗動物組織中細(xì)菌的載量進(jìn)行分析外，對于每個對應(yīng)時間點(diǎn)的動物組織(主要是肺、脾、肝)進(jìn)行病理切片分析，也是確定結(jié)核病發(fā)病過程的重要的研究數(shù)據(jù)。

基本的病理切片，主要是通過HE染色觀察組織中結(jié)核病理組織反應(yīng)的情況；更復(fù)雜的病理切片，則是需要對病理組織中相應(yīng)目的細(xì)胞或蛋白質(zhì)的組成存在進(jìn)行免疫組化的染色分析，這樣就可以更加精細(xì)地觀察和分析結(jié)核病病理代謝發(fā)展的過程[29]。

3. 系統(tǒng)的體液免疫反應(yīng)。在各種結(jié)核病動物模型的研究中，隨著技術(shù)的發(fā)展和進(jìn)步，在一般病理進(jìn)程觀察的基礎(chǔ)上，已經(jīng)需要并能夠開展系統(tǒng)的結(jié)核病體液免疫反應(yīng)數(shù)據(jù)的獲取和研究了。盡管MTB能夠引起宿主強(qiáng)烈的系統(tǒng)性抗原抗體反應(yīng)，但由于在已有的試圖應(yīng)用抗體鑒別和結(jié)核病治療中沒有成功的案例，所以對于B細(xì)胞介導(dǎo)的體液免疫反應(yīng)在結(jié)核病控制中的作用和意義，目前的理解和認(rèn)識是缺乏普遍統(tǒng)一的明確結(jié)論的。

然而對于結(jié)核病免疫反應(yīng)過程中，究竟是否存在具有保護(hù)性意義的體液免疫反應(yīng)？能夠激發(fā)宿主保護(hù)性體液免疫反應(yīng)的免疫原是什么？能夠引發(fā)宿主保護(hù)性免疫反應(yīng)的免疫原究竟有多少？這些保護(hù)性體液免疫反應(yīng)的作用機(jī)理又是什么？如何利用這些保護(hù)性體液免疫反應(yīng)進(jìn)行疫苗和診斷技術(shù)研發(fā)？想要認(rèn)識和回答以上類型的問題，首先就必須通過系統(tǒng)的臨床樣本分析和動物模型實(shí)驗，將所有結(jié)核病相關(guān)宿主體液免疫反應(yīng)的免疫原系統(tǒng)發(fā)現(xiàn)和鑒別出來，而這項工作正是當(dāng)今結(jié)核病免疫反應(yīng)機(jī)理研究最直接也是最有價值的研究工作之一[30-33](圖3)。

4. 系統(tǒng)的T細(xì)胞免疫反應(yīng)。在與體液免疫反應(yīng)同時存在并且重要的獲得性免疫反應(yīng)中，對T細(xì)胞免疫反應(yīng)在結(jié)核病免疫控制中作用的研究，是當(dāng)今結(jié)核病免疫機(jī)理研究又一個最直接也是最有價值的研究工作之一。由于這種T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫反應(yīng)也是基于對病原相關(guān)免疫原識別基礎(chǔ)上的作用，所以究竟有沒有具有保護(hù)性意義的T細(xì)胞免疫反應(yīng)？具有保護(hù)性T細(xì)胞免疫反應(yīng)的免疫原是什么？能夠引發(fā)宿主保護(hù)性T免疫反應(yīng)的免疫原有多少？這些保護(hù)性T細(xì)胞免疫反應(yīng)的作用機(jī)理是什么？如何利用這些保護(hù)性T免疫反應(yīng)？對這些必須回答和研究的問題，同樣必須要通過系統(tǒng)的臨床樣本分析和動物模型實(shí)驗，將結(jié)核病相關(guān)的全部宿主T細(xì)胞免疫反應(yīng)的免疫原系統(tǒng)地發(fā)現(xiàn)和鑒別出來[34-35](圖4)。

由于研究技術(shù)的迅速發(fā)展和成熟，基于小鼠、豚鼠和猴子的結(jié)核病體液免疫原和細(xì)胞免疫原的系統(tǒng)發(fā)現(xiàn)、鑒別和作用機(jī)理研究，已經(jīng)成為當(dāng)前結(jié)核病免疫機(jī)理全面成熟和發(fā)展的一個新的里程碑。而結(jié)核病體液免疫和細(xì)胞免疫原譜，就是今后一個全新的更高水平階段的結(jié)核病免疫研究和預(yù)防控制技術(shù)方法研究的起點(diǎn)。

5. 各種功能細(xì)胞的研究分析。這是每個突變體在功能進(jìn)一步細(xì)化研究中都會依據(jù)每位研究者的興趣和需要進(jìn)行深入研究的一些內(nèi)容。其中既有對B細(xì)胞的體外功能分析研究，又有對T細(xì)胞的體外功能分析研究，以及對先天免疫反應(yīng)細(xì)胞(如巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞)體外功能分析研究，等等。以往一般基于細(xì)胞生物學(xué)功能的研究，是一類相對獨(dú)立的宿主細(xì)胞-微生物病原相互作用分析的研究。在基于結(jié)核病系統(tǒng)的獲得性免疫反應(yīng)機(jī)理研究中，對可能引發(fā)系統(tǒng)宏觀免疫性狀變化的更基礎(chǔ)的更直接的功能細(xì)胞反應(yīng)方式和變化，進(jìn)行深入全面地分析研究，對于結(jié)核病免疫反應(yīng)的形成和機(jī)理研究都是非常重要和必然要進(jìn)行的進(jìn)一步工作[36-38]。

6. 是否形成潛伏感染。由于對結(jié)核病免疫反應(yīng)機(jī)理研究的核心是立足于人結(jié)核病免疫反應(yīng)機(jī)理上的，因此能夠最大程度地滿足對人結(jié)核病模擬的結(jié)核病動物模型是最理想的。現(xiàn)有的結(jié)核病動物模型中，仍然沒有任何一個模型可以完全滿足以上這樣的需求。因此，能夠在一定程度上滿足研究需求的動物模型，同時互相之間又可以補(bǔ)充和印證的不同結(jié)核病動物模型就非常必要[39]。

到目前為止，結(jié)核病小鼠實(shí)驗?zāi)Ｐ偷臐摲腥臼亲畛墒焱晟频膶?shí)驗?zāi)Ｐ停欢捎诓±磉^程上的缺陷，使其在結(jié)核病發(fā)生機(jī)理研究中的價值受到很大限制。但由于小鼠可以進(jìn)行純遺傳品系的控制，也就是理論上所有實(shí)驗小鼠從遺傳組成上可以是完全一致的，這就為小鼠結(jié)核病動物模型的穩(wěn)定提供了無可比擬的優(yōu)勢；同時，由于可以很容易地構(gòu)建出一個針對宿主因素在結(jié)核病免疫反應(yīng)中的作用的基因敲除的突變體小鼠，從而提供一個無可替代的、可更加深入研究宿主因素是如何控制結(jié)核病免疫調(diào)控機(jī)理的強(qiáng)大的研究工具。

豚鼠和猴子模型中存在一個同樣的限制，那就是豚鼠和猴子缺乏遺傳上純系的實(shí)驗動物品系。由于實(shí)驗中采用的不同動物個體之間遺傳組成上的差異，帶來一個不利的結(jié)果就是在被MTB侵襲的不同個體之間，其對細(xì)菌的免疫反應(yīng)能力可能是存在遺傳差異的。以往由于結(jié)核病免疫研究試劑和技術(shù)的限制，對豚鼠和猴子結(jié)核病免疫機(jī)理的研究實(shí)際上是不系統(tǒng)和不深入的。在MTB突變體文庫技術(shù)的條件下，利用小鼠結(jié)核病動物模型深入研究結(jié)核病免疫調(diào)控機(jī)理已經(jīng)成為這個領(lǐng)域研究和競爭的核心；而同時利用豚鼠和猴子結(jié)核病模型全面研究結(jié)核病免疫機(jī)理的研究，就成為這個領(lǐng)域中必須進(jìn)行的新的重大機(jī)遇和挑戰(zhàn)。

7. 慢性復(fù)發(fā)的調(diào)控異同。在初步開展的實(shí)驗中，已經(jīng)觀察到有些基因敲除的MTB其致病能力是降低的，有些突變體的致病能力是升高的，有些突變體是不能進(jìn)入潛伏感染狀態(tài)的。由于細(xì)菌基因敲除突變體在宿主動物中引發(fā)結(jié)核病免疫反應(yīng)的眾多變化，為我們在科學(xué)實(shí)驗的基礎(chǔ)上充分研究和認(rèn)識潛伏性結(jié)核感染的機(jī)理，以及潛伏性結(jié)核感染復(fù)發(fā)的機(jī)理提供了前所未有的技術(shù)能力和機(jī)遇。

充分利用MTB基因突變體文庫，在小鼠慢性結(jié)核病動物模型的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步構(gòu)建完善的豚鼠慢性結(jié)核病動物模型和非人靈長動物慢性結(jié)核病動物模型，并在這樣系統(tǒng)的動物模型基礎(chǔ)上，徹底研究MTB各個基因突變體在3種動物模型中能夠引發(fā)的宿主免疫反應(yīng)及其相應(yīng)的變化，結(jié)合我國臨床結(jié)核病患者廣泛的結(jié)核病免疫反應(yīng)數(shù)據(jù)，將會為結(jié)核病免疫機(jī)理的研究帶來革命性的影響和認(rèn)識。

(四)數(shù)據(jù)結(jié)論的價值

1. 第一階段的核心數(shù)據(jù)框架。這個基于結(jié)核病3種動物模型的MTB全基因組突變體系統(tǒng)實(shí)驗研究的體液免疫反應(yīng)和T細(xì)胞免疫反應(yīng)數(shù)據(jù)，結(jié)合臨床各類結(jié)核病患者和潛伏感染者日益積累的豐富的獲得性免疫反應(yīng)數(shù)據(jù)，就是當(dāng)前新技術(shù)條件下國際水平的結(jié)核病免疫反應(yīng)和免疫反應(yīng)調(diào)控機(jī)理研究第一階段的核心數(shù)據(jù)框架。

結(jié)核病比較免疫學(xué)核心數(shù)據(jù)框架，具有2個維度的構(gòu)成和認(rèn)識能力。第一個維度是不同免疫反應(yīng)構(gòu)成的物種基礎(chǔ)，即小鼠、豚鼠和猴子，這個物種維度中之所以不包括人類，是由于這個維度的數(shù)據(jù)構(gòu)成需要通過系統(tǒng)可控的MTB致病性感染實(shí)驗獲得，而這一點(diǎn)對于人類是完全不適用的。第二個維度是單獨(dú)基因缺失差異的MTB突變體(突變體文庫)，由于每一個突變體相較于野生型MTB有且僅有一個編碼基因的缺失，而所有突變體之間除被敲除的基因外其他的遺傳基因組成都是完全相同的，所以構(gòu)成了對MTB每一個編碼基因在特定宿主物種結(jié)核病免疫調(diào)控中的作用認(rèn)識(圖5，6)。

2. 1/4000的學(xué)術(shù)認(rèn)識和成就。結(jié)核病具有復(fù)雜性，其根本原因和奧秘都存在于MTB基因組編碼的4000多個基因的遺傳密碼中。對于這樣復(fù)雜疾病的免疫機(jī)理的認(rèn)識，必然是需要逐步遞次解決和積累的。無論是基于判斷和猜測的、還是沒有預(yù)先判斷和猜測的，對MTB每一個編碼基因在結(jié)核病發(fā)生發(fā)展過程中可能的功能作用的研究，都是最終真正解決結(jié)核病發(fā)病機(jī)理研究所必須的。

作為宿主-MTB互作整體調(diào)控結(jié)果的感染免疫性狀，長期的研究事實(shí)證明，必須應(yīng)用先進(jìn)的科學(xué)研究的技術(shù)手段，將MTB每一個編碼基因在結(jié)核病宿主免疫調(diào)控過程中的作用逐個進(jìn)行研究分析，才是解決結(jié)核病問題必須的科學(xué)過程。在當(dāng)前技術(shù)條件下，這樣的研究是能夠完成的。對每個MTB基因敲除突變體的3種動物模型的研究，都是結(jié)核病免疫反應(yīng)調(diào)控第一階段1/4000問題的落實(shí)和解決，都將是結(jié)核病比較免疫學(xué)核心數(shù)據(jù)框架的4000個節(jié)點(diǎn)中的一個。

結(jié)核病標(biāo)準(zhǔn)比較T細(xì)胞免疫原譜：小鼠、豚鼠、猴子分別感染H37Rv野生型菌株后，正常結(jié)核病下各自識別全基因組蛋白質(zhì)T細(xì)胞免疫原的比較；結(jié)核病基因突變體比較T細(xì)胞免疫原譜：小鼠、豚鼠、猴子各自感染相同基因敲除突變體菌株后，宿主針對該突變體感染各自識別全基因組蛋白質(zhì)T細(xì)胞免疫原的比較

3. 現(xiàn)階段技術(shù)能力下的重要成果。在人類征服結(jié)核病的漫長過程中，離開了細(xì)致而精密的科學(xué)實(shí)驗去解決結(jié)核病免疫反應(yīng)機(jī)理的想法是非常有害的。在技術(shù)和社會能力條件具備的情況下，本研究領(lǐng)域能力的提高和發(fā)展需要全領(lǐng)域的研究者都能及時地站在本領(lǐng)域先進(jìn)科學(xué)技術(shù)水平的基礎(chǔ)上。在20世紀(jì)90年代，全球結(jié)核病研究再次興起的時候，在缺乏足夠分子生物學(xué)技術(shù)及生物安全三級動物實(shí)驗條件支持的情況下，我國結(jié)核病免疫研究在國際上始終處于落后的狀況。

經(jīng)過近30年的社會經(jīng)濟(jì)發(fā)展和技術(shù)進(jìn)步，在已經(jīng)掌握了結(jié)核病領(lǐng)域與國際同步的MTB基因敲除的先進(jìn)技術(shù)，在成熟的結(jié)核病小鼠動物模型基礎(chǔ)上，在國際上亟待成熟完善的豚鼠模型構(gòu)建上，在技術(shù)難度最大而臨床前評價意義最大的猴子模型全面成熟構(gòu)建的競爭中，把握這個歷史性的發(fā)展機(jī)遇，成為當(dāng)前技術(shù)條件下結(jié)核病科學(xué)和技術(shù)研究的高水平國家，從而使我國結(jié)核病免疫機(jī)理研究普遍而系統(tǒng)地達(dá)到國際水平，無論對于我國結(jié)核病研究的未來，還是對于結(jié)核病免疫調(diào)控機(jī)理的突破，都具有非常現(xiàn)實(shí)而又重要的歷史意義。

4. 基于科學(xué)數(shù)據(jù)的新研究機(jī)會和方向。所有新學(xué)術(shù)領(lǐng)域的發(fā)展，都是在既有新技術(shù)條件下優(yōu)先完成本領(lǐng)域國際水平科學(xué)研究的基礎(chǔ)上必然要發(fā)生的事件。在結(jié)核病必須來自3個動物模型的系統(tǒng)研究中，就如當(dāng)初MTB基因組測序完成時產(chǎn)生的時代變遷一樣，從此以后這個領(lǐng)域的研究水平必須站在這個基礎(chǔ)之上才能夠具有真正的科學(xué)價值。

當(dāng)前，如果進(jìn)行結(jié)核病世界先進(jìn)水平的研究，必須完成的一個新的基礎(chǔ)工作，就是首先完成MTB全基因組規(guī)模突變體文庫的構(gòu)建。突變體是結(jié)核病比較免疫學(xué)構(gòu)建中必須的工具和材料。在完成MTB全基因組規(guī)模基因敲除突變體文庫構(gòu)建后，通過對這些突變體在結(jié)核病免疫調(diào)控過程中的作用進(jìn)行研究，就是全球結(jié)核病免疫機(jī)理研究領(lǐng)域的競爭核心。

支撐結(jié)核病免疫調(diào)控機(jī)理系統(tǒng)研究的科學(xué)實(shí)驗，需要由結(jié)核病小鼠動物模型、結(jié)核病豚鼠動物模型、結(jié)核病猴子模型三者組成。在動物模型數(shù)據(jù)框架基本構(gòu)建成型的時候，結(jié)合臨床結(jié)核病免疫反應(yīng)的數(shù)據(jù)，人類對于結(jié)核病免疫機(jī)理的研究、認(rèn)識和利用必將達(dá)到一個全新的高度。

六、我國在結(jié)核病比較免疫學(xué)發(fā)展中的優(yōu)勢

在結(jié)核病比較免疫學(xué)大發(fā)展的歷史性過程中，我國的科研工作者是其中的重要競爭力量，必然將會做出很多重要的貢獻(xiàn)。這也是我國在結(jié)核病比較免疫學(xué)領(lǐng)域發(fā)展中已經(jīng)形成的所具備的優(yōu)勢條件所決定的。

(一)我國結(jié)核病全國防控的現(xiàn)實(shí)需要

世界衛(wèi)生組織《2020年全球結(jié)核病報告》[40]估算，2019年全球新發(fā)結(jié)核病患者約為1000萬例，其中結(jié)核病死亡患者約為120萬例，另有20.8萬例HIV陽性結(jié)核病患者死亡。我國2019年新發(fā)結(jié)核病患者約為83.3萬例，死亡患者約為3.1萬例。

結(jié)核病在歷史上曾經(jīng)是全球所有國家都要面臨的重大傳染病控制難題。隨著科學(xué)技術(shù)和經(jīng)濟(jì)衛(wèi)生水平的發(fā)展，一些發(fā)達(dá)國家結(jié)核病的影響已經(jīng)得到有效的控制。現(xiàn)在受結(jié)核病影響嚴(yán)重的主要是第三世界經(jīng)濟(jì)欠發(fā)達(dá)的國家。隨著我國經(jīng)濟(jì)技術(shù)發(fā)展水平的提升和發(fā)展，在規(guī)范和普遍的結(jié)核病防控管理下，對我國結(jié)核病的現(xiàn)狀和形勢已經(jīng)有了更加具體客觀的認(rèn)識。對于結(jié)核病臨床和防控所必須的新的藥物、新的疫苗和有效公共衛(wèi)生管理措施的研究和需要，不同于其他發(fā)達(dá)國家主要由科學(xué)家研究興趣決定，這些都是由我國所面臨的結(jié)核病防控現(xiàn)實(shí)這一重大社會需求所決定的。

(二)不斷壯大成長的結(jié)核病科研隊伍

由于結(jié)核病臨床治療現(xiàn)實(shí)的需要和公共衛(wèi)生控制的需要，隨著我國結(jié)核病防控工作的持續(xù)推進(jìn)和發(fā)展，在臨床和公共衛(wèi)生領(lǐng)域已經(jīng)逐漸形成了一個相當(dāng)龐大的結(jié)核病專業(yè)領(lǐng)域群體。從臨床診斷到臨床治療，從分子診斷到免疫診斷，從形態(tài)觀察到分子研究，在所有傳染病防控治療各個層面和水平，都已經(jīng)形成一支具有相當(dāng)實(shí)力的研究者隊伍。

尤其是在全球合作開放的結(jié)核病防控管理形式下，通過愈漸頻繁和深入的人員技術(shù)交流，掌握了分子生物學(xué)技術(shù)、分子遺傳學(xué)技術(shù)、現(xiàn)代免疫學(xué)技術(shù)的科研人員逐漸形成了一定的規(guī)模，已經(jīng)逐漸具備了開展具有國際水平結(jié)核病免疫機(jī)理研究的人員技術(shù)條件。隨著我國經(jīng)濟(jì)技術(shù)迅速發(fā)展和提高，正在有越來越多的研究經(jīng)費(fèi)來支撐廣泛而持續(xù)的結(jié)核病免疫機(jī)理的研究。

(三)全球獨(dú)有的結(jié)核病臨床數(shù)據(jù)能力

結(jié)核病免疫機(jī)理研究質(zhì)變發(fā)展的標(biāo)志，就是結(jié)核病比較免疫學(xué)的形成和發(fā)展。在這個承前啟后的領(lǐng)域劃時代發(fā)展的基礎(chǔ)點(diǎn)上，需要2個部分的數(shù)據(jù)構(gòu)成。第一部分是必然的實(shí)驗研究數(shù)據(jù)，來源于可以系統(tǒng)控制的結(jié)核病動物模型實(shí)驗，第二部分是全面的臨床免疫數(shù)據(jù)，來源于系統(tǒng)全面的結(jié)核分枝桿菌感染者和結(jié)核病患者的臨床數(shù)據(jù)。

在MTB標(biāo)準(zhǔn)毒株基因突變體文庫的工具性標(biāo)準(zhǔn)病原體群的基礎(chǔ)上，通過對遺傳免疫特征特性不同的小鼠、豚鼠、猴子進(jìn)行的系統(tǒng)免疫調(diào)控機(jī)理研究，結(jié)合小鼠可以純系(受試個體遺傳組成完全相同)研究的實(shí)驗，可以極大限度獲得僅僅由MTB單個基因缺失引發(fā)的宿主免疫反應(yīng)變化；在此基礎(chǔ)上，通過已有的豚鼠和猴子系統(tǒng)實(shí)驗研究，將可以獲得更進(jìn)一步關(guān)于MTB單個基因缺失可以引發(fā)不同遺傳免疫組成物種的宿主免疫反應(yīng)變化。

我國大量的MTB感染者和結(jié)核病患者，在成為重大的公共衛(wèi)生和社會問題的同時，賦予我國真正能夠?qū)⒒诮Y(jié)核病動物模型研究獲得的系統(tǒng)結(jié)核病免疫學(xué)認(rèn)識轉(zhuǎn)變成對人結(jié)核病免疫機(jī)理認(rèn)識的歷史性機(jī)遇。在無法對人進(jìn)行MTB突變體文庫逐個基因免疫調(diào)控功能研究的情況下，我國已經(jīng)擁有且可以臨床有效管理的大量的結(jié)核病患者和MTB感染者，使我國成為當(dāng)前世界上唯一有能力獲得最全面、最豐富的臨床結(jié)核病免疫反應(yīng)分析數(shù)據(jù)的國家。當(dāng)基于當(dāng)前國際水平的結(jié)核病系統(tǒng)動物免疫調(diào)控機(jī)理數(shù)據(jù)框架，同全球最完整和最豐富的臨床結(jié)核病免疫反應(yīng)數(shù)據(jù)相結(jié)合的時候，所形成的結(jié)核病比較免疫學(xué)體系必將極大地推進(jìn)結(jié)核病免疫機(jī)理研究的突破和發(fā)展。

(四)映于動物而聚于人用的學(xué)術(shù)目的

在結(jié)核病比較免疫學(xué)形成和成熟之前，雖然基于動物模型結(jié)核病研究的目的是服務(wù)于人類科學(xué)認(rèn)識并解決結(jié)核病問題的，但由于不同宿主生物在免疫調(diào)控機(jī)理上的天然遺傳組成差異，這些來源于動物研究的數(shù)據(jù)和認(rèn)識除了能提供一般意義的理論和參考外，很大程度上仍然不能直接反映臨床人類結(jié)核病發(fā)生的機(jī)理。

在面對MTB這種由近乎4000個編碼基因組成的復(fù)雜病原體時，由于臨床人群中被感染者和結(jié)核病患者遺傳構(gòu)成上的巨大差異，不同個體出現(xiàn)的相關(guān)免疫反應(yīng)究竟主要是由感染細(xì)菌特性決定的，還是由宿主免疫調(diào)控差異決定的，僅僅靠臨床數(shù)據(jù)的收集和觀察是完全無法進(jìn)行具有循證實(shí)驗科學(xué)意義研究的，即無法通過遺傳學(xué)的可控手段直接證明其中因果關(guān)系。沒有系統(tǒng)結(jié)核病動物模型免疫機(jī)理研究支持的臨床免疫學(xué)數(shù)據(jù)，這樣的數(shù)據(jù)和認(rèn)識就會更多地被限制在觀察和相關(guān)性認(rèn)識的領(lǐng)域，對于疫苗和藥物研發(fā)的指導(dǎo)作用是間接而有限的。

基于動物模型的結(jié)核病免疫調(diào)控機(jī)理的研究，不僅是我們探索生命奧秘的理論研究，同時更是我們研究新型結(jié)核病疫苗和新型結(jié)核病控制藥物的應(yīng)用需求。基于臨床結(jié)核病免疫反應(yīng)的觀察和分析，不是要在臨床宿主和細(xì)菌組成復(fù)雜的借口之下將人結(jié)核病免疫機(jī)理的研究同動物模型研究獲得的進(jìn)展脫離開來，而是要充分借鑒可控的遺傳學(xué)實(shí)驗，從遺傳的因果關(guān)系上獲得我們對結(jié)核病發(fā)病機(jī)理的更客觀更接近真理的認(rèn)識(表1)。

(五)蓄積于循證醫(yī)學(xué)領(lǐng)域能力的大爆發(fā)

結(jié)核病研究領(lǐng)域最大的機(jī)遇包含這樣2個基本的內(nèi)容。第一，是需要通過全面廣泛的臨床實(shí)踐，從實(shí)際工作中收集、梳理、發(fā)現(xiàn)真正的科學(xué)問題。隨著結(jié)核病臨床診斷和治療技術(shù)的發(fā)展提高，以往主要由個人經(jīng)驗判斷的很多問題，已經(jīng)逐漸成為可被科學(xué)技術(shù)定義和解決的內(nèi)容。這里必須強(qiáng)調(diào)的一個問題是，由于在實(shí)驗科學(xué)中對共性技術(shù)條件的掌握和認(rèn)識在實(shí)踐中必然存在差異，在面對臨床實(shí)踐中(包括各種類型的研究實(shí)驗)各種紛繁復(fù)雜的現(xiàn)象和問題時，一個非常關(guān)鍵的問題是如何保證我們當(dāng)下發(fā)現(xiàn)和提出的是的確需要解決的客觀科學(xué)問題。

第二，在具備了基于循證臨床實(shí)踐篩選、發(fā)現(xiàn)和確定必須解決的科學(xué)問題時，以嚴(yán)密實(shí)驗科學(xué)的實(shí)證認(rèn)識和技術(shù)，對相關(guān)臨床問題進(jìn)行研究和解決，這是現(xiàn)代醫(yī)學(xué)和實(shí)驗生物學(xué)發(fā)展的共同目的和要求。通過結(jié)核病比較免疫學(xué)實(shí)驗動物數(shù)據(jù)框架逐步完善的過程，秉持客觀而邏輯實(shí)證的技術(shù)認(rèn)識，在我國結(jié)核病領(lǐng)域培養(yǎng)鍛煉形成領(lǐng)域普遍的設(shè)計和應(yīng)用這種技術(shù)研究的能力，將會必然地推動我國成為國際循證醫(yī)學(xué)研究實(shí)力型的國家。

七、把握機(jī)遇，引領(lǐng)結(jié)核病比較免疫學(xué)時代的到來

(一)牢牢把握遺傳學(xué)實(shí)驗數(shù)據(jù)支撐的技術(shù)核心

在結(jié)核病新型疫苗研究和藥物研究的過程中，全球性的瓶頸問題是對于結(jié)核病發(fā)病過程的免疫機(jī)理不夠全面、系統(tǒng)和深入。在MTB引發(fā)宿主免疫反應(yīng)的問題上，什么樣的免疫反應(yīng)是保護(hù)性的免疫反應(yīng)？什么樣的免疫反應(yīng)是致病性的？小鼠、豚鼠、猴子和人的結(jié)核病免疫反應(yīng)是否相同？不同物種中保護(hù)性免疫反應(yīng)的組成和機(jī)理是什么？這些問題對于今后臨床結(jié)核病的疫苗研發(fā)、診斷技術(shù)、藥物研發(fā)等都是無法回避的客觀難題。而研究和回答這樣的問題，就必須在國際水平的科學(xué)技術(shù)能力的基礎(chǔ)上，用實(shí)驗科學(xué)的手段一點(diǎn)一點(diǎn)地加以解決。

(二)掌握結(jié)核病領(lǐng)域?qū)嶒灴茖W(xué)的先進(jìn)技術(shù)能力

隨著國際分子生物學(xué)和分子遺傳學(xué)技術(shù)的全面突破和發(fā)展，相較于20世紀(jì)末和21世紀(jì)初，人類在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的研究能力已經(jīng)得到極大的飛躍和提升。在結(jié)核病研究領(lǐng)域，在MTB基因敲除技術(shù)發(fā)明之前，對于MTB致病能力的遺傳機(jī)理研究基本為零，對于分枝桿菌基因代謝調(diào)控的分子生物學(xué)機(jī)理的研究則一直都是觀察性和描述性的，結(jié)核病動物模型的研究和發(fā)展也是非常有限的。而隨著MTB基因敲除技術(shù)的出現(xiàn)，以及MTB全基因組測序工作的完成，結(jié)核病相關(guān)的微生物學(xué)、遺傳學(xué)和動物實(shí)驗研究就都迅速進(jìn)入到一個前所未有的分子技術(shù)時代。

表1 結(jié)核病比較免疫學(xué)的數(shù)據(jù)框架及其價值意義

在解決結(jié)核病問題的臨床和公共衛(wèi)生實(shí)踐中，能夠及時學(xué)習(xí)、理解、掌握、應(yīng)用本專業(yè)領(lǐng)域先進(jìn)的科學(xué)技術(shù)工具，是解決問題做出貢獻(xiàn)的根本方式。在全球結(jié)核病免疫機(jī)理研究最為激烈的競爭中，MTB基因敲除技術(shù)、結(jié)核病動物模型技術(shù)(小鼠、豚鼠和猴子)、獲得性免疫反應(yīng)系統(tǒng)研究分析技術(shù)、功能細(xì)胞分離分析技術(shù)，都已經(jīng)成為結(jié)核病免疫調(diào)控機(jī)理研究必須掌握的實(shí)驗技術(shù)。在我們?nèi)粘５难芯抗ぷ髦胁荒芷毡槭褂眠@些研究技術(shù)及跟上這些基本技術(shù)的發(fā)展，不能充分地理解和掌握這些基本技術(shù)的使用技能，任何人的研究工作都將無法產(chǎn)生具有學(xué)術(shù)和應(yīng)用價值的結(jié)果，也就無法跟上這個領(lǐng)域的進(jìn)步和發(fā)展，也就不再有機(jī)會和可能成為結(jié)核病領(lǐng)域具有國際水平的競爭者。

(三)全領(lǐng)域普及實(shí)驗科學(xué)共性的技術(shù)邏輯法則

結(jié)核病比較免疫學(xué)形成和發(fā)展中的貢獻(xiàn)和成就不是靠偶然的幾個人或幾個實(shí)驗就可以實(shí)現(xiàn)的。因為MTB的遺傳組成的復(fù)雜，4000多個編碼基因的功能認(rèn)識是需要系統(tǒng)的動物模型實(shí)驗和其他體外生物化學(xué)、生物物理、細(xì)胞學(xué)和免疫學(xué)等多方面研究分析的，這也就必然需要很多的科研人員參與到這個領(lǐng)域的研究中來。雖然參與這個領(lǐng)域的學(xué)者眾多，領(lǐng)域眾多，但在每一個人的實(shí)驗中，需要遵循的實(shí)驗原則和數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)都是相同的，其中任何科學(xué)技術(shù)邏輯和標(biāo)準(zhǔn)的錯用和缺失都會導(dǎo)致時間、資金和社會公共資源的極大浪費(fèi)。

在結(jié)核病所有類型的動物實(shí)驗中，之所以必須設(shè)有野生型菌株的對照實(shí)驗，是因為每個單獨(dú)的突變體功能研究中的野生型MTB的對照標(biāo)準(zhǔn)，可以將不同研究的數(shù)據(jù)形成過程、數(shù)據(jù)分析、實(shí)驗結(jié)論等進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)一致的比較、評價和分析。目前在我國進(jìn)行的結(jié)核病免疫機(jī)理研究中，對于必須的先進(jìn)技術(shù)的實(shí)際掌握情況來看，總體上與國際普遍水平仍然存在很大的差距。在全球結(jié)核病比較免疫學(xué)發(fā)展貢獻(xiàn)的這場競爭中，在結(jié)核病科研領(lǐng)域全面實(shí)現(xiàn)依賴于MTB突變體和系統(tǒng)動物模型的技術(shù)掌握，已經(jīng)成為決定我國結(jié)核病免疫機(jī)理研究事實(shí)水平高低的關(guān)鍵。

(四)在個人成就發(fā)展中形成領(lǐng)域的實(shí)力主流

實(shí)踐中經(jīng)常會碰到一個很普遍的問題，就是在很多正在從事結(jié)核病研究的科研工作者中，對于國際結(jié)核病領(lǐng)域技術(shù)現(xiàn)狀理解不足，對結(jié)核病領(lǐng)域競爭研究的熱點(diǎn)和重點(diǎn)不夠敏感。主要的表現(xiàn)就是一般在設(shè)計自己的實(shí)驗和研究內(nèi)容時，普遍內(nèi)收在對自己曾經(jīng)熟悉的技術(shù)使用上，而對于當(dāng)前結(jié)核病研究領(lǐng)域中必須掌握的領(lǐng)先技術(shù)則抱有習(xí)慣性的排斥和戒備心理，從而人為地壓低了自己的學(xué)術(shù)目標(biāo)和能力發(fā)展。

在國內(nèi)已經(jīng)跨過一般研究技術(shù)和經(jīng)費(fèi)條件限制的情況下，科研人員如果不能掌握必要的新技術(shù)，也就必然會導(dǎo)致研究者始終不能跨出自己已經(jīng)落后的研究水平限制。而隨著時間和研究資源的流失和浪費(fèi)，這樣的科研人員被國外同行繼續(xù)拋棄和碾壓也就是其低水平實(shí)驗工作的必然結(jié)果。因此，積極而堅定地克服對新技術(shù)的畏難和恐懼情緒，主動學(xué)習(xí)和掌握領(lǐng)域中國際領(lǐng)先的實(shí)驗技術(shù)，并在研究實(shí)踐中實(shí)現(xiàn)自己科研能力的持續(xù)發(fā)展和提高，是所有當(dāng)代我國結(jié)核病科研人員，特別是年輕科研人員能夠逐步成長，并真正成為日后全球結(jié)核病領(lǐng)域高水平專家的必由之路。

(五)基于結(jié)核病比較免疫學(xué)的變異調(diào)控研究新時代

當(dāng)前國際上結(jié)核病免疫機(jī)理研究的技術(shù)起點(diǎn)就是MTB基因敲除突變體技術(shù)。由于個人專業(yè)能力、研究興趣、領(lǐng)域?qū)I(yè)和預(yù)期判斷有別，尤其是全球不同國家面臨的現(xiàn)實(shí)需要的不同，雖然結(jié)核病免疫機(jī)理系統(tǒng)研究的技術(shù)準(zhǔn)備已經(jīng)成熟，但不同國家結(jié)核病研究領(lǐng)域的需求迫切性也是不同的。

結(jié)核病總體研究技術(shù)最全面發(fā)達(dá)的美國，由于結(jié)核病問題并不是其社會公共衛(wèi)生核心的迫切需要，所以在這個領(lǐng)域的研究工作主要是以科研人員個人研究興趣為主的競爭。雖然研究的技術(shù)能力和理論深度很有競爭力，但是就MTB感染中所有編碼基因在結(jié)核病免疫調(diào)控中的作用和機(jī)理，由于工作量和所需經(jīng)費(fèi)的巨大，短時間之內(nèi)是不會形成完全覆蓋性的革命性的成果。

結(jié)核病比較免疫學(xué)的形成和發(fā)展，是結(jié)核病領(lǐng)域先進(jìn)科學(xué)技術(shù)進(jìn)步帶來的必然結(jié)果，也是我國結(jié)核病領(lǐng)域前所未有的歷史性機(jī)遇。在結(jié)核病臨床治療、預(yù)防和診斷現(xiàn)實(shí)問題巨大的社會需求壓力下，在結(jié)核病比較免疫學(xué)系統(tǒng)的支持下，我國結(jié)核病新型疫苗研發(fā)和結(jié)核病新型藥物研發(fā)必將會獲得前所未有的發(fā)展和提高，結(jié)核病免疫機(jī)理領(lǐng)域的研究將很快會進(jìn)入一個全新的高速發(fā)展的時代。

免疫調(diào)控技術(shù)在臨床腫瘤治療和自體免疫性疾病治療中日益發(fā)揮重大作用的當(dāng)下，借用結(jié)核病免疫機(jī)理的研究和機(jī)會，在解決結(jié)核病疫苗、治療和診斷技術(shù)需求的同時，也將允許對宿主不同的免疫反應(yīng)和免疫反應(yīng)調(diào)控機(jī)理進(jìn)行全面而深刻的認(rèn)識，從中衍生和發(fā)展出的特定免疫反應(yīng)調(diào)控技術(shù)不僅將貢獻(xiàn)于結(jié)核病問題的解決，也為解決其他更多的臨床問題提供了無可替代的機(jī)遇和可能。

(六)機(jī)會，每個人成就的必然和偶然

作為歷史悠久的也是最成功的感染性疾病，結(jié)核病免疫機(jī)理的復(fù)雜性是醫(yī)學(xué)領(lǐng)域研究中眾所周知的事實(shí)。正是由于結(jié)核病免疫機(jī)理的復(fù)雜，所以在當(dāng)代相關(guān)研究新技術(shù)誕生20年后的今天，全球結(jié)核病研究領(lǐng)域的專家在經(jīng)歷了曾經(jīng)公認(rèn)的“關(guān)鍵基因和疫苗”期待之后，又被迫回到進(jìn)行徹底全面分析研究結(jié)核病有效免疫原的這個起點(diǎn)上來。所以僅僅憑借既往的一些認(rèn)識和猜測就想“征服”結(jié)核病的觀點(diǎn)和認(rèn)識，必然是無法滿足人類對結(jié)核病免疫機(jī)理研究需要的。構(gòu)建并完善結(jié)核病比較免疫學(xué)，并逐步細(xì)化其中的每一個精細(xì)功能實(shí)驗和分析，是人類解決結(jié)核病問題的唯一希望。

結(jié)核病比較免疫學(xué)的數(shù)據(jù)，是需要通過對MTB每一個基因突變體對宿主免疫反應(yīng)調(diào)控影響的實(shí)驗來獲得的。每一個突變體，都將需要進(jìn)行小鼠、豚鼠和猴子結(jié)核病模型的實(shí)驗研究，實(shí)現(xiàn)對小鼠結(jié)核病免疫反應(yīng)機(jī)理的系統(tǒng)認(rèn)識，實(shí)現(xiàn)對豚鼠結(jié)核病免疫反應(yīng)機(jī)理的系統(tǒng)認(rèn)識，實(shí)現(xiàn)對猴子結(jié)核病免疫反應(yīng)機(jī)理的系統(tǒng)認(rèn)識。這樣每一個全面的實(shí)驗研究結(jié)果，與臨床結(jié)核病免疫反應(yīng)數(shù)據(jù)結(jié)合在一起，將形成結(jié)核病比較免疫學(xué)基本的組成數(shù)據(jù)。所以在這個過程中，每一個研究的結(jié)果都將是在最終認(rèn)識和了解結(jié)核病免疫反應(yīng)的機(jī)理之路上扎實(shí)前行的一步。

在全球結(jié)核病比較免疫學(xué)發(fā)展的競爭中，針對MTB每一個基因免疫調(diào)控功能的系統(tǒng)動物實(shí)驗，都是破解結(jié)核病終極奧妙的一次嘗試。通過這樣系統(tǒng)的實(shí)驗研究，將要收獲的不僅僅是科學(xué)研究成果的論文報告，收獲的更有可能是在這個領(lǐng)域的學(xué)術(shù)發(fā)展中做出重要甚至重大的社會貢獻(xiàn)。尤其重要的是，在這個全領(lǐng)域研究提高的過程中，掌握了結(jié)核病免疫調(diào)控機(jī)理研究先進(jìn)科學(xué)技術(shù)并成長起來的眾多科研人員，必將成為未來結(jié)核病領(lǐng)域真正具有國際水平競爭能力的科學(xué)人才。