中藥通過調控線粒體自噬保護心肌缺血再灌注損傷的研究進展#

文靜 李智 張建武 牛娜△

（1.川北醫學院藥理教研室，四川 南充，637100；2.川北醫學院附屬醫院藥劑科，四川 南充 637100）

缺血性心臟病是全球死亡率最高的疾病之一，目前，利用手術和藥物快速有效地恢復冠脈血流是治療缺血性心血管病的主要方法，在心梗后血運重建、冠脈溶栓、冠脈支架植入術、冠脈搭橋術、心肺復蘇及休克后，均有可能出現心肌缺血再灌注損傷（Myocardial ischemia reperfusion injury，MIRI），進一步誘發心肌功能障礙，臨床亟需新的治療方法和預防手段。

研究顯示，缺血再灌注損傷心肌可占全部梗死心肌面積的50%[1]。目前公認的MIRI 有4 種表現形式：再灌注誘發的心律失常、心肌頓抑、微血管阻塞、致死性心肌再灌注損傷，其中前兩種表現形式是可逆的，而后兩種是不可逆的[2]。因此，目前MIRI 已成為患者從缺血后復流獲益的主要障礙，如何預防和減少再灌注損傷是臨床上亟待解決的問題。

心血管系統的細胞和組織對能量要求較高，而線粒體是介導能量生成的主要細胞器，線粒體自噬是特異性清除受損線粒體的一種選擇性自噬，在維持細胞穩態中發揮重要作用。近年來研究表明，線粒體自噬在缺血性心臟疾病中起著重要作用。中醫藥在防治心血管疾病方面療效顯著，實驗研究也越來越深入，很多中藥及復方的作用機制得到闡明。本文就近幾年報道可通過調控線粒體自噬途徑保護心肌缺血再灌注損傷的中藥及復方進行歸納總結，以期為心肌缺血再灌注損傷的臨床治療提供新的研究方向。

1 線粒體自噬

線粒體是介導能量生成、氧化應激和細胞凋亡的主要細胞器，是細胞內氧化磷酸化和合成三磷酸腺苷的主要場所，其形態與數量、合成和降解均受到精確的調控。線粒體自噬作為特異性清除受損線粒體的一種選擇性自噬，在細胞穩態和各種生理過程中發揮重要作用[3]。線粒體自噬受多種因素的調控，在正常情況下，細胞通過自噬來清除受損或功能障礙的線粒體，但是當線粒體自噬過程受阻或過度自噬時會導致各種疾病的發生和發展[4]。因此線粒體自噬必須保持一定程度上的平衡，自噬不足或過度都可能導致細胞走向死亡，從而加速疾病進程。

線粒體自噬的整個過程可大致分為3 個步驟：①線粒體受到損傷后膜通透性發生改變，膜電位降低導致線粒體去極化，激活線粒體自噬相關蛋白；②自噬體包裹并隔離受損線粒體，形成線粒體自噬體；③線粒體自噬體與溶酶體融合形成線粒體自噬溶酶體，然后在酸性環境下降解內容物[5]。目前已知主要有三條通路可調控線粒體自噬，即 PINK1/Parkin 通路、BNIP3/NIX 通路和FUNDC1 通路[6]。

1.1 PINK1/Parkin 通路

PINK1-Parkin 介導的線粒體自噬是哺乳動物細胞線粒體自噬最常見的方式，也是目前研究最清楚的一條通路[7]。PINK1（PTEN induced putative kinase 1）作為一種廣泛存在于細胞質中的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，在正常生理情況下，PINK1 通過線粒體內膜轉運蛋白（Translocator inner membrane，TIM）和線粒體外膜轉運蛋白（Translocator outer membrane，TOM）轉運至線粒體內膜。在線粒體內膜上，被基質加工肽酶（Matrix processing peptidase，MPP）剪切氨基端線粒體靶向序列。早老素相關菱形蛋白（Presenilin associated rhomboid likeprotein，PARL）剪切PINK1 的氨基酸A103 至F104 跨線粒體內膜的疏水序列，導致在胞質中的PINK1 被泛素蛋白酶體系快速降解[8]。因此PINK1 在細胞內維持低水平。但在MIRI 等病理條件下，ROS 會損傷線粒體，受損的線粒體因缺乏電子傳遞導致膜電位下降或者未折疊蛋白反應將PINK1 轉運至線粒體外膜，從而逃避PARL 的剪切和蛋白降解。PINK1 聚集在功能失調的線粒體外膜上，此時PINK1 會改變泛素分子，改變的泛素隨后會招募Parkin 到受損的線粒體上，通過對Parkin 和泛素磷酸化激活Parkin E3 連接酶活性。然后，Parkin 泛素化線粒體外膜融合蛋白1（Mitofusin 1，MFN1）和線粒體外膜融合蛋白2（Mitofusin 2，MFN2）等使線粒體泛素化。隨后泛素化的蛋白被自噬受體蛋白OPTN、P62、NDP52 等識別。同時，微管相關蛋白1 輕鏈3（Microtubule-associated protein 1 light chain 3，LC3）和自噬體膜也被募集到受損線粒體周圍，與自噬受體結合并吞噬受損的線粒體形成自噬體，隨后在溶酶體內降解受損的線粒體。PINK1 和Parkin 位于同一條通路的上下游，協同介導了線粒體的自噬。

1.2 BNIP3/NIX 通路

BNIP3/NIX 與P62 相似，具有LIR 模體，可與LIR 結合作為自噬受體誘導線粒體自噬的發生。目前研究表明BNIP3 和LC3 直接相互作用，介導了線粒體自噬的發生[9]。BNIP3 和NIX 在蛋白序列上具有同源性，但在線粒體自噬過程中BNIP3和NIX 的表現略有不同，在哺乳動物紅細胞分化過程中發生的線粒體自噬是由NIX 介導的，而在低氧條件下線粒體和內質網的選擇性清除是由BNIP3 介導的。

1.3 FUNDC1 通路

FUNDC1 是僅位于線粒體外膜的蛋白，在正常情況下，FUNDC1 能被蛋白激酶Src 磷酸化，而磷酸化的FUNDC1 和LC3 的相互作用比較弱，FUNDC1 的功能受到抑制，因此FUNDC1 能穩定存在于線粒體外膜而不介導線粒體自噬的發生。在低氧的情況下，蛋白激酶Src 的活性降低，導致FUNDC1 磷酸化水平的降低，從而促進其與LC3 相互作用和線粒體自噬的發生。FUNDC1 的18 位酪氨酸磷酸化是線粒體自噬的分子開關。

2 中醫理論下心肌缺血與線粒體自噬

中醫理論認為，心主血脈，血脈瘀阻則會出現胸痹、心悸等癥狀，故缺血性心臟病在中醫常歸屬于“胸痹、心痛、真心痛、厥心痛”等范疇。其病癥最早記載于《黃帝內經》：“脈虛則血虛，血虛則痛”，初有心痛之描述，至東漢時期，張仲景在《金匱要略》中正式提出胸痹概念：“陽微陰弦，即胸痹而痛”。其病機主要為本虛標實，虛實夾雜，標實以血瘀、痰濕、氣滯、寒凝為主，本虛主要是氣虛、陰虛。據此，中醫針對冠心病的治則主要有活血化瘀法、宣痹通陽法、芳香溫通法、調整脾胃法、益氣養陰法、補腎固本法等。

中醫理論認為“氣”是組成人體和維持人體基本生命活動的本元，有學者對中醫“氣”和西醫“線粒體”在來源、形態、功能、臨床表現、預防治療等方面的相關性進行了研究，認為中醫“氣”與西醫“線粒體”的作用非常相似。線粒體可產生能量證實氣化功能的體現，線粒體自噬的過程是清除受損的線粒體以維持細胞的穩態，這與中醫的益氣活血法相符合。線粒體自噬所發揮的作用即是中醫益氣活血法的微觀體現。故推測，中醫藥治療缺血性心臟病的主要作用靶點與線粒體密切相關[10，11]。

3 中藥參與調節線粒體自噬保護心肌缺血的相關機制

線粒體自噬的程度對心肌細胞保護起到雙向作用。具體表現為，正常情況下，心肌細胞自噬維持在一定的水平，這種基礎水平自噬是一種分解代謝平衡途徑，對減少心肌細胞死亡，維持心臟功能具有重要作用。而在心肌缺血階段，自噬降解非功能性胞質蛋白，為關鍵生命活動提供關鍵營養，從而抑制細胞凋亡和壞死。因此，心肌缺血時自噬水平提高，可分解受損細胞器或異常蛋白質為心肌代謝提供能量，維持心肌收縮力。若自噬下調，大量有害物質則會在細胞內積聚，導致細胞受損及死亡，加重疾病的發展。

隨著現代生物學研究的深入，越來越多的中藥及復方被證實可以通過調控不同的信號通路來調節線粒體自噬從而改善缺血/再灌注后的心肌細胞損傷。

3.1 調控PINK1/Parkin 通路

PINK1/Parkin 信號通路是線粒體自噬中最常見的通路，也是研究最清楚的一條通路，研究發現，很多中藥及復方可以通過調控該通路來調節線粒體自噬，最終改善心肌細胞損傷。

劉超等研究發現，丹皮酚可通過激活PINK1/Parkin 信號通路促進線粒體自噬，進而減輕心肌細胞損傷，改善大鼠心臟功能和心室重構情況[12]。李旭陽等研究了黃芪甲苷對缺血再灌注誘導的大鼠心肌細胞及線粒體自噬的調節作用機制，結果顯示黃芪甲苷可通過降低PINK1、Parkin、p62、L3Ⅱ的表達，調控PINK1/Parkin 通路[13]。有實驗研究顯示，梓醇干預可上調缺氧缺糖H9c2心肌細胞Beclin1、LC3 和Parkin 表達，下調P62、PINK1 表達，并出現明顯的自噬小體，小體中包裹著破損的線粒體[14]。提示梓醇可通過上調PINK1/Parkin 通路，激活線粒體自噬來減輕心肌缺血損傷。丹參酮ⅡA 是丹參的主要活性成分之一，王佳楠等通過研究發現丹參酮ⅡA 能降低心肌缺血大鼠心肌線粒體中Beclin1 的表達和LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的比值，能促進P62 蛋白的表達，同時大鼠心肌損傷情況得到明顯改善，推測丹參酮ⅡA 可通過抑制線粒體過度自噬來達到保護心肌的目的[15]。葒草苷對心肌缺血/再灌注損傷大鼠心肌細胞內線粒體具有明顯保護作用，其機制可能與通過Parkin 依賴性和Parkin 非依賴性信號通路抑制心肌細胞內線粒體自噬過度激活有關[16]。黃連素是中藥黃連的主要活性成分，臨床常用于治療痢疾桿菌和大腸桿菌引起的腸道感染，近幾年的研究發現黃連素對缺血性心臟病也有獨特的調控作用。有研究顯示黃連素預處理可上調缺氧4h、復氧3h H9c2 心肌細胞PINK1、Parkin 蛋白含量，激活PINK1/Parkin 通路，促進線粒體自噬，減輕MIRI[17]。五味子總木脂素是五味子的活性成分之一，有研究顯示五味子總木脂素可使衰老模型小鼠腦組織中LC3Ⅱ/LC3Ⅰ蛋白表達水平降低。體外實驗也表明五味子總木脂素干預后小鼠大腦皮質和海馬神經元中LC3 蛋白陽性細胞數減少，其作用機制與五味子總木脂素調節自噬作用有關[18]。

栝樓薤白半夏湯出自漢代張仲景所著的《金匱要略》，由栝蔞實、薤白、半夏等組成，具有行氣解郁，通陽散結，祛痰寬胸的功效，現代臨床常用于治療冠心病心絞痛等疾病的治療。動物實驗研究顯示，栝樓薤白半夏湯能顯著降低MIRI 大鼠血清CK-MB、LDH 含量，下調大鼠心肌Beclin-1、P62、PINK1、Parkin 蛋白表達，上調Mfn2 蛋白表達，提示栝樓薤白半夏湯可通過抑制Pink1/Parkin 信號通路，減輕線粒體自噬而發揮心肌保護作用[19]。

通心絡是根據絡病理論所創立的復方中藥，由人參、水蛭、全蝎、赤芍、蟬蛻、土鱉蟲、蜈蚣、檀香、降香、乳香（制）、酸棗仁（炒）、冰片組成。該方具有益氣活血、通絡止痛的功效，臨床主要用于冠心病心絞痛屬心氣虛乏、血瘀絡阻證的治療。實驗研究顯示，通心絡緩解心肌缺血再灌注損傷和調控心肌細胞自噬水平密切相關，通心絡可通過PINK1/Parkin 線粒體自噬通路清除損傷線粒體，并和泛素蛋白酶系統協同處理錯誤折疊蛋白的降解，維持細胞內平衡，保護心肌細胞[20]。

益氣活血方為臨床經驗用方，由生黃芪、人參、當歸、川芎、三七組成。陳曦通過實驗研究發現，心肌梗死后，自噬蛋白與基因表達于7 天時增加，28 天時減少，運用益氣活血方可以于7 天、28 天動態調節心肌細胞自噬蛋白與基因表達，于7 天時抑制LC3A、LC3B、Beclin1 蛋白表達，于28 天時促進LC3A、LC3B、Beclin1 蛋白表達[21]。

加味丹參飲以補氣活血為法，由丹參、黃芪、赤芍、檀香、紅花、當歸、川芎等藥組成。實驗證實，加味丹參飲能上調缺氧/復氧大鼠心肌細胞中自噬相關蛋白LC3-Ⅱ及Beclin-1 的表達，增強細胞自噬，保護損傷的心肌細胞[22]。

痰瘀同治方由瓜蔞、薤白、清半夏、柴胡、赤芍、川芎、黃連、甘草等組成。動物實驗表明，痰瘀同治方能抑制心肌缺血再灌注模型大鼠缺血期Beclin-1 mRNA 的表達以及再灌注期Beclin-1、LC3 mRNA 的表達，表明痰瘀同治方可通過促進缺血期自噬發生及抑制再灌注期自噬的過表達而發揮對心肌缺血再灌注損傷心肌的保護作用[23]。

3.2 調控BNIP3/NIX 通路

丹酚酸B 是丹參中的一種酚類化合物，辛高杰采用H9c2 細胞探討丹酚酸B 保護缺氧/復氧損傷的機制是否與調控NIX 介導的線粒體自噬有關，實驗結果顯示，丹酚酸B 能降低自噬相關蛋白LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的比值，下調NIX 蛋白的表達，提示丹酚酸B 對H9c2 心肌細胞缺氧/復氧損傷的保護作用與抑制線粒體自噬發生有關，其具體機制可能為抑制NIX 介導的線粒體自噬激活，從而升高線粒體膜電位[24]。

有研究者采用H9c2 細胞缺氧4h 復氧3h 以及大鼠缺血30min、再灌注120min 兩種模型探討黃連素對MIRI 的作用，結果體內外實驗均表明，黃連素預處理會增加LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值、BNIP3和NIX 含量，可通過激活BNIP3/NIX 通路介導的線粒體自噬減輕心肌細胞及模型大鼠的缺血/再灌注損傷[25]。但也有研究顯示[26，27]黃連素預處理可通過降低ROS 水平以及抑制BNIP3/NIX 信號通路抑制過度自噬，提示黃連素對線粒體自噬具有雙重調控作用。

3.3 調控FUNDC1 通路

雙參寧心膠囊的主要成分為人參總皂苷，丹參總酚酸，元胡總生物堿[28]。該藥具有益氣行血，化瘀止痛之功效，臨床用以治理氣虛血瘀證的“胸痹”、“心痛”。實驗研究證實，雙參寧心膠囊對大鼠心肌缺血后再灌注階段心肌細胞內線粒體自噬存在抑制作用，進一步研究發現該抑制作用可能與抑制FUNDC1 介導的線粒體自噬激活有關，而對BNIP3、NIX 介導的線粒體自噬未發現調控作用[29]。

3.4 調控AMPK-mTOR 通路

五味子具有收斂固澀，益氣生津，補腎寧心的作用。有研究發現，五味子乙素可顯著降低MIRI 模型小鼠心肌損傷指標，其機制可能與升高線粒體自噬標記蛋白環氧化酶Ⅰ的mRNA 水平、促進 Beclin1 蛋白表達水平以及激活AMPK/mTOR/ULK1 信號通路有關[30]。

血府逐瘀湯是著名活血化瘀方劑，臨床用于治療多種心血管疾病。細胞實驗證實血府逐瘀湯對缺氧/復氧H9c2 細胞具有保護作用，機制研究結果顯示血府逐瘀湯可降低LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值、下調Beclin-1 蛋白表達、抑制AMPK 活化、上調mTOR 磷酸化作用，提示血府逐瘀湯可通過調控AMPK-mTOR 信號通路抑制自噬保護缺氧/復氧心肌細胞[31]。

體外缺氧/復氧細胞實驗證實痰瘀同治方可通過調控AMPK-mTOR 通路、抑制自噬而起到心肌保護作用[32]。

3.5 調控PI3K-Akt-mTOR 通路

人參皂苷是一類固醇類化合物，主要存在于人參屬藥材中，也是人參的主要活性成分。實驗研究顯示，人參皂苷Rg1 能降低缺血再灌注模型大鼠LC3Ⅱ/Ⅰ和Beclin1 表達水平，升高P62 表達水平，通過激活PI3K-Akt-mTOR 信號通路抑制過度的線粒體自噬，保護心肌細胞缺氧損傷及體內大鼠心肌缺血/再灌注損傷[33]。

4 小結與展望

綜上所述，線粒體自噬與心肌缺血再灌注損傷關系密切，主要體現在兩個方面，一方面，早期適度的自噬可以清除受損線粒體從而保護心肌細胞；另一方面，晚期過度自噬會吞噬正常線粒體進一步損傷心肌。

中藥具有多成分、多靶點的特點，可同時對多條信號通路產生影響，實驗研究也證實，很多中藥、復方或提取物對線粒體自噬具有雙重調控作用，當自噬不足時可激活線粒體自噬途徑，當自噬過度時，可抑制線粒體過度自噬。其機制主要與調控PINK1/Parkin 通路、BNIP3/NIX 通路、FUNDC1 通路、AMPK-mTOR 通路、PI3K-Akt-mTOR 通路等信號通路有關。但目前的研究對藥物和化合物種類覆蓋還不夠全面，單味藥提取物的研究主要局限于黃酮類、皂苷類以及酚類成分，對其它成分的研究較少；中藥復方的研究主要局限于具有補氣、活血、化瘀、行氣、通絡功效的復方。今后應在中醫藥理論之下，加強中藥及復方的基礎實驗研究，進一步闡明中醫藥對心肌缺血再灌注損傷的保護作用機制，為臨床心肌缺血再灌注損傷的治療提供更多的參考價值。