補體調節劑治療骨關節炎研究進展

（山東省醫學科學院 藥物研究所，山東第一醫科大學，山東 濟南 250062）

骨關節炎（OA）又稱退行性關節病[1]，其主要以關節邊緣軟骨異常增生、軟骨脫落為病理特征[2]，臨床表現為慢性關節疼痛、腫脹、活動時伴有摩擦聲等，終末期可致患者關節畸形甚至喪失行走能力[3]。對于OA治療，傳統藥物大多僅能緩解癥狀，無法控制疾病進展，效果不明顯，還會引發不良反應。外科手術能快速延緩關節損傷，但不能很好地解決關節軟骨修復與重建問題,更不能逆轉關節軟骨進一步被破壞的進程[2,4]。蛋白質組學技術和質譜法研究表明[5]，補體蛋白在OA患者的關節滑液中發生異常表達，主要包括C3，C4，C5補體蛋白的異常增多，從而引起補體激活，C3和C5轉化酶形成增加，最終導致膜攻擊復合物（membrane attack complex，MAC）生成增多，促進關節損傷和炎癥。本文對OA基于補體系統的分子發病機制進行分析，并總結幾種針對C3，C4和C5的補體蛋白調節劑，旨在為OA治療提供更多有效方案。

1 補體系統在OA發生發展中的免疫發病機制

研究表明，OA是先天免疫系統介導的較低程度的炎癥[5]。分析OA患者滑液和細胞膜發現，先天性免疫系統的主要細胞和因子，包括補體激活片段和其促炎受體，均以明顯升高的水平存在于關節滑膜中，表明補體系統在OA組織損傷中有重要作用[6]。研究發現，OA患者關節滑液中的補體激活后，會產生多種補體成分，其中C3和C5轉化酶進一步形成膜攻擊復合物，在靶細胞膜上形成膜孔通道，導致細胞裂解，引發關節炎癥；同時，補體激活產物過敏毒素與補體激活誘導的趨化因子相互作用也引起骨損傷加重[6]。補體系統是先天免疫系統防御病原體的首要防線之一，是由30余種蛋白質組成的不耐熱蛋白水解級聯反應攻擊性系統[7]，其成分復雜，包括直接參與補體激活的各種補體固有成分、調控補體激活的各種因子和分布于細胞膜上的補體受體等[8]。補體系統一般有宿主防御和通過過敏素和B、T淋巴細胞刺激來指導適應性免疫調節的作用。因此在OA的分子機制中，還有另一條促使炎癥形成的路徑，即當宿主細胞受到某種刺激時，攻擊系統啟動，補體被激活，其中激活產生的C3和C5轉化酶可誘導產生C3a和C5a過敏素，兩種過敏素可誘導白細胞等免疫細胞產生炎癥因子，通過激活絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）信號通路，最終形成OA[9]。綜上所述，滑膜關節中補體系統的失調在OA的發病機制中起至關重要的作用。或可通過減少補體激活產物生成，防止細胞裂解，減輕關節炎癥。

2 基于補體系統的幾種補體調節劑

補體系統激活引起的軟骨細胞裂解是目前較為認可的OA發病機制，可由經典途徑、替代途徑和凝集素途徑任意一條途徑完成，再經一系列絲氨酸蛋白酶的級聯反應，形成MAC、趨化因子和促炎因子等介質[10]。基于補體系統的調節劑能將抑制補體系統激活作為治療OA的首要目標。同時，補體成分的多樣性和補體效應蛋白又為OA的干預治療提供了多個潛在靶點。根據導致細胞裂解的MAC的主要組分，將補體蛋白調節劑分為C3補體蛋白調節劑、C4補體蛋白調節劑、C5補體蛋白調節劑和新型融合蛋白補體調節劑。

2.1 C3補體蛋白調節劑在OA治療中的作用

C3補體蛋白是補體系統中的主要成分，也是補體激活途徑中的重要中間體。補體激活的3種途徑均匯集于激活C3補體蛋白，生成C3轉化酶，與多種補體因子和非補體因子相互作用，引發各種生物學效應。在OA的發生發展過程中，C3蛋白一方面形成C3轉化酶，進一步誘導MAC形成；另一方面誘導生成C3a過敏素，引起免疫細胞分泌趨化因子，同時C3b還與CR3補體受體連接引發吞噬作用，共同促進OA發生[11]。因此，抑制C3a和C3轉化酶形成，可有效治療骨關節炎癥。羧肽酶B（carboxypeptidase，CPB），是一種由Cpb2基因編碼，肝臟循環產生，凝血酶-血栓調節蛋白復合物激活的纖維蛋白溶解抑制劑。有文獻報道[12]，CPB已被證明可裂解和滅活幾種炎癥蛋白，如C5a、C3a、緩激肽和凝血酶裂解的骨橋蛋白等。Christin等[13]研究表明，OA滑液中CPB的水平可能升高，并在緩解局部C5a介導的炎癥中起關鍵作用，且體外實驗表明CPB很可能通過幾種不同的方式抑制MAC形成，從而保護關節免受炎癥破壞。靶向CPB治療是否在OA臨床試驗中有保護作用尚待確定。另外，衰變加速因子CD55（decay accelerating factor，DAF，CD55）和膜輔因子蛋白（membrane cofactor protein，MCP，CD46）均有控制C3轉化酶的功能。

有文獻報道[14]，sushi域結合蛋白4（sushi domain-containing protein 4，SUSD4）也能通過抑制經典途徑中C3轉化酶形成，抑制補體激活。由于基因剪接選擇性的存在，含SUSD4結構域的蛋白一般為膜結合蛋白或可溶性蛋白，如可溶性因子H或膜結合的CD46，通常與活化的組分C3b和C4b結合，并誘導絲氨酸蛋白酶因子Ⅰ降解，從而阻礙C3轉化酶形成[15]。但SUSD4只在食道、腦和心臟等組織中有較高的表達，還沒有相關文獻表明其可在軟骨組織表達[16]。Nikolina等[17]研究表明，膠原蛋白Ⅸ的N末端非膠原結構域4（N-terminal noncollagenous domain 4，NC4）可作為補體系統的新型抑制劑發揮作用，能與C4、C3和C9補體成分結合，并直接抑制C9聚合從而抑制MAC組裝，促進補體成分C4b和C3b的酶促裂解，加速對C3的裂解，抑制補體激活。血漿H因子（factor H，fH）是替代途徑的主要調節因子，促進因子I介導的C3b蛋白水解為iC3b 1，加速C3轉化酶的衰變[18]。fH的補體調節功能大多歸功于其與FHR家族（FHR-1，FHR-2，FHR-3，FHR-4，FHR-5）的相互作用，其中FHR-1起主要作用，通過阻止C5經由C5轉化酶裂解，從而抑制C5a釋放，減少C5b-9形成，達到調節補體末端途徑激活，減少細胞裂解的目的[19-20]。

2.2 C5補體蛋白調節劑在OA治療中的作用

C5是補體系統中的重要組分，直接參與補體活化過程，其活化產物C5a過敏毒素可誘導免疫細胞分泌炎癥因子，通過C5a受體C5aR1介導促炎作用，從而促進宿主防御，且能調節組織體內平衡。過敏毒素C5a是先天免疫的有效介體[21]，在外源性和內源性病原體及損傷相關分子模式激活補體系統后，通過其受體C5aR1促進炎癥。在成骨細胞中，C5a誘導了炎癥細胞因子白介素6（interleukin-6，IL-6）和IL-8的遷移和表達，對骨質形成和活性至關重要[22]。敲除了C5aR1基因的小鼠關節中破骨細胞數量減少，骨量顯著增加，表明C5a/C5aR1信號可能調節骨骼的生理轉換[23]。病理條件下，缺乏C5aR1的小鼠可抵抗關節炎侵害，且C5aR1的活性與骨骼中大量骨丟失有關，C5aR1拮抗劑可顯著減少該模型中的牙周炎癥和隨后的骨質流失[24]。隨后發現，成骨細胞是C5a的靶細胞[25]，因為成骨細胞特異性C5aR1過表達的小鼠顯示出骨折愈合受損[26]。Yvonne等[27]分析了C5aR1激活后的基因表達模式和細胞內信號轉導途徑，發現還涉及MAPK和胰島素途徑基因的強調控。此外，還證明了C5aR1和Toll樣受體2（Toll-like receptor 2，TLR2）在成骨細胞中相互作用，導致免疫細胞趨化因子上調，這可誘導破骨細胞重新吸收[28]。這些結果表明，補體激活的成骨細胞能與破骨細胞和免疫細胞協同調節炎癥性骨疾病期間的炎癥環境。

Wang等[15]研究證明了單克隆抗體（anti-C5 monoclonal antibody，mAb）能抑制C5處的末端補體激活，使C5a與C5aR1結合減少，減弱促炎作用，減少骨損傷，表明抗C5的單克隆抗體能有效防止并延緩膠原誘導型關節炎發生。CD59是一種有效阻止MAC形成的膜蛋白，該膜蛋白可通過抑制其他C9分子插入C5b-9復合物的方式，抑制大型MAC形成，維持軟骨細胞的完整性[29]。Bloom等[30]研究雄性小鼠CD59a基因缺失對維持骨骼結構的影響，結果表明CD59a基因缺失可導致骨骼體積變大，密度變小，使小鼠更易患OA。另外，內源性補體調節蛋白還包括衰變加速因子CD55，主要通過抑制體內C3、C5轉化酶形成阻止補體活化。目前，針對C5補體蛋白調節劑藥效動力學研究，提出了新型特異性抗體重組抗C5微型抗體MB12/22[31]，其能特異性識別人補體C5，參與補體激活抑制過程，關節內注射的MB12/22能減少關節滑膜的損傷，緩解關節腫脹，降低腫瘤壞死因子水平，改善組織形態學變化。

2.3 C4補體蛋白調節劑在治療OA中的作用

C4補體蛋白是滑液中同源型補體因子C4a和C4b的混合物[32]，也是經典途徑和凝集素途徑中的共同成分，能裂解補體激活經典途徑中的C3補體。C4b結合蛋白（C4-binding protein，C4BP）是經典和凝集素途徑的主要可溶性內源抑制劑，是一種血漿寡聚糖蛋白，其主要功能包括調節補體激活和止血。有文獻報道[33]，C4BP不僅與凝血有關，在成纖維細胞的結締組織重塑過程中也可能起作用。纖維蛋白在滑膜組織內沉積是滑膜炎的一個突出特征，纖維蛋白-成纖維細胞相互作用可能是滑膜細胞活化導致獲得OA侵襲性表型的決定因素。每個C4BP鏈均有一個C4b2結合位點，C4BP主要通過與膜結合性維生素K依賴性蛋白S相互作用[34-35]，從而減少C3轉化酶形成，抑制補體激活的經典途徑。通過這種機制，可防止潛在有害的補體過度活化。

對于OA，調控補體系統失調的控制因子還有很多，怎樣將自身免疫系統的補體抑制劑作用放大并用于臨床將是目前防治的關鍵。為了防止補體介導的組織損傷，系統的活化和抑制之間需要通過幾種可溶性膜結合的抑制劑建立良好的平衡。大多數抑制劑通過以下兩種途徑起作用：加速補體轉化酶的衰變，或通過絲氨酸蛋白酶Ⅰ因子促進活化的補體因子C3b和C4b的酶促裂解。1型補體受體（complement receptor1，CR1）或稱CD35是紅細胞、白細胞等膜上的糖蛋白，有加速補體因子衰變的活性，并作為輔酶促進C3b、C4b對C3的裂解作用，是一種有效的補體激活抑制劑[36]。能輔助C3b、C4b裂解作用的因子還有很多，如fH為一種主要的補體可溶性抑制劑，通常與活化的組分C3b和C4b結合，并誘導絲氨酸蛋白酶Ⅰ因子降解[37]，還可阻止替代途徑中補體C3轉化酶組裝并加速其降解[38]。另外，Sj?berg等[39]進一步驗證了fH與纖維調節蛋白（fibromodulin，FMOD）和骨黏附素（osteoadherin，OSAD）結合，能增強彼此的補體抑制活性。該研究在闡明補體和細胞外基質成分之間相互作用方面取得了一些進展，可指導開發對抗異常補體激活的新型療法。

2.4 融合蛋白作為補體調節劑在治療OA中的作用

新型融合蛋白能特異性靶向作用于某種補體蛋白，將大大提高其對補體系統的抑制效果。為進一步評估補體系統在OA動物模型中的作用，Banda等[40]研究了含有補體受體2（complement receptor 2，CR2）和fH的重組替代途徑抑制劑CR2-fH（complement receptor 2 and factor H，CR2-fH）對膠原誘導型OA模型小鼠的治療作用[41]。該試劑包含編碼來自CR2的iC3b/C3d結合位點的氨基末端結構域和替代途徑誘導的OA小鼠fH的5個短重復序列的氨基末端[42]。在對含Ⅱ型膠原蛋白和Ⅱ型膠原單克隆抗體的免疫復合物進行的體外研究中，小鼠滑膜和軟骨中的C3沉積顯著降低，C3a生成減少，MAC生成顯著減少，關節損傷減輕。表明CR2-fH有體外特異性靶向C3補體作用，并特異性抑制補體激活的替代途徑，對經典途徑的影響最小，對凝集途徑幾乎無影響[42]。Michelfelder等[43]研究了一種新穎的組合方法，合成新的融合蛋白MFHR1。該蛋白將fH的調節域與FHR-1的C5轉化酶/C5b-9抑制片段連接起來。在功能上，該蛋白將fH的C3調控域和其能靶向細胞表面的結構域，與衍生自FHR-1的C5b-9形成抑制末端途徑調控域結合起來，通過同時靶向C3和末端途徑來調節補體激活。OA體外試驗中，MFHR1在抑制C5轉化酶激活和C5b-9組裝方面表現出輔助因子和衰變加速功能，阻止C3b沉積并減少C3a、C5a和C5b-9的生成[44]。結果表明，MFHR1能在多個級聯水平上同時靶向補體激活，可提供優化的補體抑制作用，主要抑制經典途徑和替代途徑的活性。因此，MFHR1可能為補體相關疾病的治療提供新的基礎。與單獨靶向C3或C5的方法相比，調節劑在補體級聯中同時影響多個效應位點[45]，包括抑制C3抑制、C5裂解抑制和C5b-9形成。特別是由于MFHR1還可阻止C3a和C5a形成及C3裂解產物積聚，有望對其他補體相關疾病中的局部炎癥和疾病進展產生積極影響。除了MFHR1調節補體過度活化的治療潛力外，這種多靶點策略可指導開發更多新的補體療法。

3 總結與展望

隨著人們對OA病理機制的深入了解，補體系統成分的多樣性和復雜性為補體多靶點治療提供依據，為盡快尋找有效的OA治療藥物，新型融合蛋白補體抑制劑的開發可作為未來治療OA的研究重點。相信隨著各種新方法和生物學新技術的開發應用，OA的治療效果會越來越好。