自噬與糖尿病睪丸損傷相關性研究進展

張 欣 馬小茹

(佳木斯大學 基礎醫學院，黑龍江 佳木斯 154007)

糖尿病是一種全球流行病，目前影響全球4億多成年人，預計到2040年將增加到6億多人[1]。這是一種以高血糖為特征的復雜的慢性代謝系統疾病，由胰島素作用和/或分泌受損引起，易引發血管并發癥,可導致多器官功能損傷和衰竭，男性睪丸損傷是糖尿病常見的慢性并發癥之一[2]。隨著糖尿病的發病率增高，男性睪丸損傷導致的不育癥的患者也日益增多。研究顯示[3]，糖尿病生殖損傷是導致男性不育癥的重要原因之一，對人類的生殖健康具有嚴重的危害。該病的特點是性器官病變，性激素水平紊亂和精子細胞結構缺陷。其病因和發病機制復雜，是多因素的，包括肥胖[4]，高血糖[5]，脂代謝紊亂以及年齡，病程等。這都與糖尿病引起的男性生殖障礙有著密切關系。近年來，隨著對自噬的研究越來越深入，人們認識到糖尿病男性睪丸損傷的發生發展過程與自噬的參與密不可分[6]，自噬的調控極可能會成為糖尿病男性睪丸損傷新的潛在治療靶點。

自噬存在于所有真核生物中，是受自噬相關蛋白(ATG)調控的細胞內降解系統，細胞物質通過該系統被遞送至溶酶體并在溶酶體中降解。然而，自噬的目的不是簡單地消除這些物質成分，而是作為一種動態的循環系統，為細胞修復和體內平衡產生新的構件和能量[7，8]。它可以通過單個或多個信號路徑，通過各種內部或外部刺激來觸發。此外，在不利的情況下，低氧、活性氧(ROS)和未折疊蛋白的積累也可引起自噬作為細胞保護機制。自噬體的生物發生始于起始的吞噬膜[9]，然后，激活的UNC-51樣激酶1(ULK1)復合物被募集到起始吞噬細胞膜上，并使膜上的磷脂酰肌醇磷酸化，形成磷脂酰肌醇-3-磷酸酯(PI3P)[10]。PI3P將效應蛋白吸收到該膜上，隨后，吞噬細胞膜經歷伸長，延伸階段需要ATG5-ATG12偶聯系統和微管相關蛋白輕鏈3(LC3)/ATG8偶聯系統，然后形成雙膜自噬體[11]。成熟的自噬體與溶酶體融合以形成自溶體。自噬不僅通過降解非必需的細胞質成分來提供能量，還能夠維持細胞體內穩態。有趣的是，有研究[12]發現，暴露于外源性應激刺激后，自噬的抑制作用可促進睪丸支持細胞的存活，研究認為過度的自噬反而會加速細胞的凋亡。研究數據表明自噬的抑制是解釋支持細胞(SC)應對壓力的穩健性的可能機制。這更加證明了一點：自噬是把雙刃劍，且其發揮保護作用的機制也是有兩面性的。有實驗研究發現，鏈脲佐菌素(STZ)誘導的糖尿病大鼠睪丸中自噬相關蛋白Beclin1，LC3的表達明顯降低，這說明了在糖尿病狀態下睪丸組織自噬被抑制[13]。根據各種實驗數據和現象證明，自噬參與了糖尿病睪丸損傷的發生發展，值得引起更多的關注。因此，就男性睪丸組織的自噬現象以及糖尿病男性睪丸損傷自噬相關信號通路的研究進展作一綜述。

1 睪丸細胞的自噬現象

睪丸是男性主要的生殖器官，由曲精細管和間質細胞組成，其生精作用和分泌性激素作用共同促進精子的生長發育，并保證正常的性功能。研究表明，睪丸組織中均有不同水平的自噬，如睪丸支持(sertoli)細胞、睪丸間質(leydig)細胞、脂質吞噬。尤其脂質吞噬[14]的自噬現象研究更為新穎。

1.1 睪丸支持(sertoli)細胞

支持細胞呈不規則的高錐體形，細胞基部附著在基膜上，頂部伸至曲精小管腔面，是睪丸結構的第二大特征，睪丸不能在沒有支持細胞幫助的情況下產生成熟的生殖細胞。應充分認識到它們在睪丸組織中的中心位置[15]，其在男性生殖器官中的生精功能中發揮著重要的作用。支持細胞受損以鏡下大量生殖細胞脫落等形態變化為典型特征，幾乎參與了所有睪丸損傷生殖障礙的病理發展過程。支持細胞或已成為男性不育的治療靶點。

睪丸支持細胞存在著較明顯的自噬現象，并且在睪丸的正常生長發育和男性不育癥的病理發展中都有重要參與，這一過程對于維持睪丸組織的形態結構穩定和功能正常起到關鍵作用。ATG5是男性生殖細胞發育中的一種核心自噬蛋白，有實驗研究[16]表明，將雄性小鼠生殖細胞中的ATG5條件性失活，然后檢測自噬指標。實驗結果顯示睪丸自噬體標記LC3A/B-II的表達顯著降低，自噬受體SQSTM1/p62的表達顯著增加，這表明睪丸自噬活性降低，且雄性小鼠的生育能力急劇下降，約70%的小鼠不能生育，極大地增加了罹患男性不育癥的幾率。這提示自噬可保護睪丸組織，是支持細胞在應激狀態下的有效保護機制。研究表明[17]，在山羊睪丸支持細胞(SC)的細胞質中發現了許多自噬體和溶酶體，它們圍繞著生精小管基部隔室中的生精細胞。在較晚的階段，SC表現出自噬體和自溶酶體，在頂體形成不同階段的精子發生過程中，與多囊泡體(MVB)一起使用。在SC的細胞質中發現了許多包埋的細長的精子，被自噬成分和MVB包圍。在透射電鏡下，自噬體的平均直徑為952.35 nm，自溶酶體的平均直徑為504.38 nm。總的來說，這些結果表明，自噬在SC中活躍，并且隨著精子發生從SC的基底腔向腔腔的發展，自噬的水平變得更加明顯。在高血糖狀態下，自噬在睪丸組織中是受抑制的，且精子的存活率和精子活力也受到抑制，而睪丸的支持細胞是在睪丸生精作用中發揮著重要影響。核因子E相關因子(2cnuclear factor E2 related factor 2,Nrf2)是諸多細胞信號道路中最重要的一種，是一種基礎轉承調節因子。有實驗[18]表明，睪丸支持細胞在受到氧化應激刺激時會使Nrf2通路表達下降，鏡下觀察細胞數量明顯減少，部分細胞形態不規則。而已有文獻報道[19]自噬通過破壞Nrf2加劇糖尿病的睪丸氧化損傷。綜合來看，研究睪丸支持細胞自噬對糖尿病引起的生殖障礙機制有新的啟示。

1.2 睪丸間質(leydig)細胞

睪丸激素是重要的成年男性激素，是性發育和維持男性特征所必需的[20，21]。血清睪丸激素水平不足通常與原發性或遲發性性腺功能低下(LOH)有關[22](LOH)，這不僅與男性性功能障礙和生殖能力下降有關，而且與心血管疾病，糖尿病[23]有關。睪丸激素主要在Leydig細胞中合成，據報道該細胞自噬非常活躍[24]。最近的研究[25]表明，老年大鼠Leydig細胞的自噬活性降低，并且在大腦中具有ATG5表達的自噬缺陷型小鼠中性激素水平降低[26]。因為自噬已經通過稱為大脂質的過程參與脂質代謝，從而為細胞提供甘油三酸酯(TGs)和膽固醇的來源，所以推測自噬可能通過促進Leydig細胞中的脂質代謝而參與睪丸激素的合成。為了進一步驗證該假設，有實驗檢測到成年小鼠睪丸中LC3和脂滴(LD)的精確定位，與先前在肝細胞和巨噬細胞泡沫細胞中的發現一致[27]。根據這些研究，我們得出結論，自噬在成年小鼠Leydig細胞中極為活躍，并可能通過脂質代謝調節類固醇生成。有實驗[28]證明，在鏈脲佐菌素誘發的糖尿病大鼠模型中形態學結果顯示Leydig細胞中的細胞凋亡和壞死，其特征在于染色質碎裂和凝集，以及光滑的內質網減少，沒有脂質滴、細胞質。由于自噬是一種細胞代謝過程，利用溶酶體降解細胞成分來提供原材料，以幫助細胞在壓力條件下存活，所以在睪丸間質細胞中見到的細胞質自噬體可能是自噬活性缺陷的跡象，這與這些細胞中睪丸激素的低分泌有關。總之，這些結果證明了自噬是糖尿病患者性腺功能減退導致不育癥的重要治療方向。

2 調控自噬相關信號通路對糖尿病男性睪丸損傷發生發展的影響

糖尿病男性睪丸損傷的發生與mTOR、AMPK等通路密切相關，在細胞的營養狀況發生改變的條件下(如高血糖)，可調控自噬[29]。眾多證據表明，在正常和糖尿病睪丸損傷機體中，自噬均發揮著關鍵作用，STZ誘導的糖尿病小鼠中自噬受到抑制。因此，調控自噬相關的通路可能是一個新的方向。

2.1 mTOR通路

雷帕霉素靶蛋白(mTOR)是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶。mTOR的編碼主調節蛋白激酶，其主要調節細胞發育過程，如生長，增殖，代謝，分化，自噬，蛋白質合成，和細胞骨架調節[30]。各種各樣的細胞內和細胞外刺激可以指導這些事件，這些事件以細胞類型特異性的方式差異發生。mTOR信號的失調已經牽涉到許多人類疾病中，包括糖尿病[31]。其中，人們強調mTOR信號通路是自噬的最主要調節劑,在自噬的誘導，過程和終止中起著復雜的作用，這給糖尿病及并發癥的發病機制和防治都提出了新的觀點。MTOR通過兩種不同的信號傳導蛋白質復合物起作用：mTORC1和mTORC2。在營養素或生長因子剝奪和低細胞能量水平下，已顯示抑制mTORC1活性，誘導了自噬的發生。這表明自噬誘導和mTORC1激活緊密反向耦合，對mTORC2活性誘導自噬尚未完全了解[32]。激活mTOR會使雄性小鼠的睪丸發育缺陷，加重不育癥。研究[33]表明，mTORC1激活促進小鼠精原細胞分化，但是過度激活會導致低生育力。在實驗中，有條件地在小鼠體內敲除掉mTORC1抑制劑TSC1，小鼠表現出睪丸發育缺陷、部分生精停滯、生殖細胞過度損失、精子數量減少和生育力低下。也就是說，mTORC1的過度激活損害精子發生，使小鼠的生殖系統受到嚴重的損傷。據報道，中度自噬對高血糖[34]引起的睪丸損傷具有保護作用。而自噬異常則會導致男性不育。在各種應激和高糖條件下，信號傳導途徑是哺乳動物生殖細胞自噬的典型負調控途徑。在糖尿病男性不育癥的發病機理中，活性氧(ROS)起著至關重要的作用[35]。研究報告稱，長期高血糖生物體中過度產生的ROS會顯著抑制mTOR信號傳導途徑，從而影響細胞自噬功能，從而導致精子的變性和畸形，并影響精子的數量、運動性和附睪的功能[36，37]。近年的研究[38]表明，鏈脲菌素(STZ)誘導的1型糖尿病大鼠睪丸組織中自噬相關蛋白Beclin1、LC3表達降低，p62表達上調，這提示糖尿病大鼠睪丸組織的自噬被抑制。在雷帕霉素治療之后，睪丸Beclin1、LC3表達水平顯著升高，均p62表達水平顯著降低，睪丸組織病理改變顯著減輕。這提示雷帕霉素改善了大鼠睪丸的損傷，雷帕霉素是mTOR的抑制劑，抑制mTORC1后對糖尿病大鼠睪丸產生保護作用，提示自噬激活對睪丸具有保護作用。

自噬可能是通過mTOR通路對改善糖尿病男性生殖障礙起作用，這為臨床治療提供更多的機會。

2.2 AMPK通路

真核細胞中，AMP激活的蛋白激酶(AMPK)在調節細胞能量平衡中起主要作用。AMPK響應于細胞內腺嘌呤核苷酸水平的變化，這相對于ATP被AMP / ADP的增加所激活。AMPK的激活增加了分解代謝(ATP生成)的速率，并降低了合成代謝(ATP利用)的速率。除維持細胞內能量平衡外，AMPK還調節全身能量代謝。鑒于其在控制能量穩態中的關鍵作用，AMPK作為代謝疾病(包括2型糖尿病和癌癥)的潛在治療靶標引起了廣泛的關注[39]。近些年的研究結果顯示，在內分泌受到干擾的情況下，如黃曲霉素B1(AFB1)體內實驗顯示血清睪丸激素(T)，促黃體生成激素(LH)和促卵泡激素(FSH)的水平，減少了Leydig細胞數量并下調了水平睪丸激素生物合成相關基因的表達。體外研究表明，AFB1(10 μM)通過抑制某些T生物合成基因的表達，顯著提高ROS水平，并降低Leydig細胞的T產生。此外，AFB1通過降低pAMPK/AMPK比和增加pmTOR/mTOR比，然后進一步上調自噬和凋亡蛋白LC3，Beclin 1和BAX，誘導Leydig細胞凋亡，以及下調自噬通量蛋白P62和抗凋亡蛋白BCL-2。AFB1誘導的Leydig細胞毒性是通過抑制T-生物合成基因表達，減少Leydig細胞數量，促進ROS產生以及通過抑制AMPK/mTOR介導的自噬通量途徑誘導細胞凋亡來表征的[40]。慢性高血糖癥和活性氧(ROS)的過量產生是糖尿病生殖并發癥發展的有力預測指標，實驗[41]研究結果說明糖尿病大鼠睪丸中的ROS增多，睪丸結構損傷，精子數量和活力均降低。綜上所述，提示研究藥物可以通過上調pAMPK/AMPK比例這一角度，來進一步下調自噬，從而對大鼠睪丸起到保護作用。

3 結語

近年來，為尋找防治糖尿病不育癥的方法，越來越多的研究涉及到糖尿病不育發生發展的分子機制。自噬作為一種機體的自我保護機制，在糖尿病睪丸損傷的發生發展過程中所發揮的重要作用被越來越多的研究所證實。但是自噬究竟通過怎樣的方式，起著怎樣的作用，目前尚未取得一致的意見，想要找到治療疾病的新靶點依舊需要更多的理論和實驗支持。