基于裂區的D-最優實驗設計法優化丹參川芎嗪注射液水提工藝

趙 芳，陳澤麒，李文竹，茍 維，劉 飛，張程益，瞿海斌*

·藥劑與工藝·

基于裂區的D-最優實驗設計法優化丹參川芎嗪注射液水提工藝

趙 芳1，陳澤麒1，李文竹1，茍 維2，劉 飛2，張程益2，瞿海斌1*

1. 浙江大學藥物信息學研究所，浙江 杭州 310058 2. 貴州拜特制藥有限公司，貴州 貴陽 550008

在質量源于設計（quality by design，QbD）理念的指導下優化丹參川芎嗪注射液（and Ligustrazine Hydrochloride Injection，SMLHI）的水提工藝。首先通過篩選實驗設計確定加熱溫度、保溫時間、藥材規格和溶劑倍量為丹參水提工藝的關鍵工藝參數。隨后為了提高實驗效率，采用基于裂區的D-最優實驗設計優化SMLHI的水提工藝。為了盡可能多的提取實驗數據潛在信息，采用了響應曲面法和人工神經網絡法2種方法建立關鍵工藝參數和關鍵質量屬性之間的回歸模型。最后，選擇較優的模型進一步采用基于滿意度函數的多指標優化算法綜合考察提取液各關鍵質量屬性，確定水提工藝的最佳操作條件?；诹褏^的D-最優實驗設計可以有效提高實驗效率，同時發現人工神經網絡模型較響應曲面法模型具有更好的擬合能力和預測能力。以人工神經網絡模型為基礎進行多指標優化，最終確定SMLHI水提工藝的最佳操作條件為加熱溫度150 ℃，保溫時間84 min，藥材規格11 cm，溶劑用量為10倍。利用基于裂區的D-最優實驗設計法優化了SMLHI水提工藝，為傳統的中藥制藥工藝研究過程中面臨的工藝參數改動受限、更改成本高昂的情況提供合理的實驗設計方案，提高研究效率，降低研究成本，對不同試驗規模下中藥制藥工藝的過程研究具有較大參考價值，為中藥的工藝二次開發提供了可供參考的新方法。

質量源于設計；裂區設計；響應曲面法；人工神經網絡；丹參川芎嗪注射液；水提工藝；多指標優化算法；關鍵工藝參數；D-最優實驗設計法；關鍵質量屬性；滿意度函數

在中藥大品種二次開發中，一般需要采用實驗設計方法優化制備工藝參數[1-4]。但在實驗過程中，可能面臨某些難以改變的工藝參數、滿足不了設計的完全隨機化要求的困難。為了提高實驗效率，需要引入裂區實驗設計（split-plot experiment design）方法[5-6]。與其他實驗設計方法相比，裂區實驗設計通過主區將一個或多個作為副區的完全隨機設計、隨機區組設計、拉丁方設計等結合起來，可以適用于實驗中有部分因子較難改變的情況，在醫藥領域常用于新型藥物制劑的配方設計與優化[7-12]。在中藥制藥工藝研究中，在質量源于設計（quality by design，QbD）理念的指導下合理應用裂區實驗設計，有助于避免在研究過程中因為改變HTCF而導致后續研究中斷或對后續研究造成干擾，同時幫助提高實驗效率，減少不必要的資源浪費。

響應曲面法（response surface methodology，RSM）是一種隨機優化過程的統計學方法[13]，目前在中藥生產過程工藝優化的研究中已經有了廣泛的應用[14-15]，主要用于考察工藝參數間相互作用以及工藝參數的二次效應對工藝評價指標的影響。人工神經網絡（artificial neural network，ANN）在過程建模、優化方面具有強大的信息提取能力，較RSM可以建立更加復雜關系的模型，尤其是非線性關系，是一種多項式回歸建模的替代方法[13]。近年來，ANN在過程預測及工藝優化方面的應用越來越廣泛，并常常表現出比RSM更好的預測能力[16-17]。

丹參川芎嗪注射液（and Ligustrazine Hydrochloride Injection，SMLHI）是由丹參提取液和鹽酸川芎嗪組成的復方制劑，臨床主要用于治療閉塞性腦血管疾病及其他缺血性心血管疾病[18-20]。本研究以SMLHI生產的首要環節丹參水提工藝為研究對象，通過風險分析與篩選設計確定丹參水提的關鍵工藝參數（critical process parameter，CPP）。在此基礎上，考慮到加熱效率的調整難以隨機進行，采用基于裂區的D-最優實驗設計。同時，采用RSM和ANN兩種建模方法處理實驗設計數據，建立丹參水提工藝CPP和關鍵質量屬性（critical quality attribute，CQA）之間的定量關系。最后，選擇較優的模型用于指導實際生產，并通過多指標優化算法考察丹參提取液的綜合質量，確定最佳操作條件。

1 儀器與試劑

1.1 儀器

Cary60型紫外-可見分光光度計及Agilent1100型高效液相色譜儀，配四元梯度泵、自動進樣器、柱溫箱、紫外檢測器、ChemStation工作站，安捷倫科技有限公司；XS105、AB204-N型電子分析天平、SevenMult型pH綜合測試儀，梅特勒-托利多上海有限公司；SE6001F電子天平，奧豪斯儀器有限公司；Milli-Q超純水機，美國Millipore公司；DHG- 9123A型電熱恒溫鼓風干燥箱，上海精宏實驗設備有限公司；ZCY-15B型數控超級恒溫槽，寧波天恒儀器廠。

1.2 試劑

丹參藥材由貴州拜特制藥有限公司提供，經貴州拜特制藥有限公司茍維工程師鑒定為正品丹參（植物基原為唇形科鼠尾草屬植物丹參Bunge的干燥根和根莖），藥材中丹酚酸B含量由課題組根據《中國藥典》2015年版方法[21]測定而得；對照品丹參素鈉（批號171027，質量分數≥98%）、原兒茶醛（批號171126，質量分數≥98%）、紫草酸（批號170825，質量分數≥98%）、迷迭香酸（批號171009，質量分數≥98%）、丹酚酸B（批號171102，質量分數≥98%）、丹酚酸A（批號170920，質量分數≥98%）均購自上海融禾醫藥科技發展有限公司；苯酚（批號20141121）購自美國阿拉丁工業公司；硫酸（批號20171201）購自國藥集團化學試劑有限公司；乙腈、甲醇、甲酸、乙酸為色譜純，購自德國Merck公司；超純水由超純水系統（Milli-Q?Synthesis，美國Millipore公司）制得。

2 方法與結果

2.1 丹參水提工藝操作流程

以篩選實驗中心點實驗條件為例，取事先揀選好的5 cm長的特定丹參藥材145 g，加1160 mL水（pH 7，pH值用鹽酸和氫氧化鈉調節）浸泡12 h，期間開啟數控恒溫槽，將油預熱至140 ℃。浸泡完成后，油浴加熱升溫至沸騰，保溫60 min，傾出一提液。隨后加入1160 mL水溶液（pH 7）進行二次提取，同樣升溫至沸騰后繼續保溫60 min，傾出二提液，與一提液均勻混合，作為后續測試所需樣本溶液。

2.2 工藝評價指標選擇及分析方法

丹參素、原兒茶醛、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B以及丹酚酸A是目前丹參相關中藥制劑中主要的可追溯質量標志物[22-23]，本研究選擇這6個成分的提出率作為提取工藝效率的指征，作為工藝研究的關鍵質量屬性（critical quality attribute，CQA）。此外，提取液中雜質成分的存在不利于提取液的后續純化及精制。預實驗結果表明，糖類成分是SMLHI原料丹參提取物中的主要雜質成分，占提取物總固含量的60%以上，其存在會顯著影響產品黏度、滲透壓等[14]。綜上，本實驗選擇丹參素、原兒茶醛、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B、丹酚酸A、總糖及總固體的提出率為評價指標。

單個指標提出率計算方法如公式（1）。

提出率＝提取液中含量（濃度）×提取液質量（體積）/藥材質量 （1）

在本研究中，采用高效液相色譜與紫外檢測器聯用（HPLC-UV）法[18]測量樣品中丹參素、原兒茶醛、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B以及丹酚酸A 6種成分的含量；根據《中國藥典》[21]規定的苯酚-硫酸法測定提取液的總糖含量，藥典規定的恒重法測定提取液的總固含量。

2.3 數據處理

2.3.1 篩選實驗數據處理 為滿足對中藥注射液的安全性與有效性的雙重保證，采用加權多元線性回歸系數法篩選對結果影響較大的參數[24]。該方法已在多項中藥制藥過程工藝研究中進行了實踐，且被證明具有較好的應用價值[15-16,25-26]。在本實驗中，考慮到酚酸類成分為丹參提取物中的主要活性成分，因此在篩選CPP時重點考慮各工藝參數對酚酸類成分的影響，以各酚酸類成分在標準提取液（本研究中，以實驗設計矩陣的中心點作為標準提取液）中的含量作為權重，其與回歸模型相關系數的乘積作為該指標調整后的相關系數（adjusted correlation coefficient，ACC）。以同一工藝參數在各指標模型中ACC的絕對值之和綜合評價該工藝參數對生產工藝影響的大小，進而篩選出對水提工藝影響較大的工藝參數，進行進一步的優化。

2.3.2 優化實驗數據處理 本研究為了更好地建立CPP與CQA之間的關系，同時采用RSM和ANN兩種建模方法，并選擇較優的模型用于指導SMLHI的生產。

（1）基于RSM建立CPP和CQA之間定量模型：基于裂區的實驗設計RSM模型以公式（2）表示，由常數項、一次項、二次項、交叉項、區組效應、副區誤差和主區誤差組成。

0是常數，a、a與a為回歸系數，是水提工藝關鍵質量屬性，X是CPP，β是區組效應，ε是副區誤差，是主區誤差，模型方程中移入或移除特定項的值設定為0.10

（2）基于徑向基函數網絡建立CPP和CQA之間定量模型：徑向基函數網絡（radial basis function network，RBF）作為ANN的一種，是一種結構簡單、收斂速度快、能夠逼近任意非線性函數的網絡，較多層感知器相比較，達到相同模型精度需要的參數更少，對小樣本數據有較好的擬合效果[27-28]。本研究以各組的工藝條件作為輸入向量，輸入節點個數等于CPP的個數；隱含層中心點采用隨機選取的方式進行，基函數選用高斯函數，如公式（3）所示；輸出層為線性單元，與隱含層全連接，因此實際輸出可以用公式（4）表示。徑向基函數網絡結構如圖1所示。

Φ＝(||－u||)＝exp(?||－u||/22) （3）

為輸入向量（工藝參數），u為基函數的中心，為基函數的標準差，w為權重系數

圖1 RBF結構

為了綜合比較2種模型的性能，選擇2和預測平均相對偏差（mean relative error，MRE）對2種建模方法進行比較分析。

real為關鍵質量屬性測量值，pre為關鍵質量屬性預測值

2.3.3 基于滿意度函數確定最佳操作條件 在實際生產中，有效成分與雜質的控制往往較為矛盾，2類物質的提出規律總是呈現出較為一致的趨 勢[11,29]。為了在提取過程中盡可能多的提取出酚酸類成分，并盡可能減少雜質提出，從而降低產品后處理中分離與純化的難度，提高產品的質量，本研究綜合考量各CQA，進一步利用多指標算法確定最佳的操作條件。

滿意度函數法是一種常用的綜合多個優化目標的方法，它將各響應指標的預測值分別通過各自的滿意度函數轉化成該指標的滿意度，再將多個滿意度合并成一個總體滿意度，以便對得到的總體滿意度函數進行單目標優化[3,30]?？傮w滿意度（）的計算如公式（6）所示。

所有計算由Microsoft Office Excel 2016（美國Microsoft公司）、Design-expert 8.0.7（美國Stat-Ease公司）和Matlab R2019b（美國MathWorks公司）軟件完成。

2.4 CPP篩選

2.4.1 基于Plackett-Burman（PB）設計的CPP篩選實驗 根據實際生產經驗和文獻調研[11,29]，挑選出6個待篩選的CPP：加熱溫度（1）、浸泡時間（2）、保溫時間（3）、飲片質量（4，以藥材中丹酚酸B含量表示）、藥材規格（5，藥材切碎程度）和溶劑pH值（6）。并進一步采用PB實驗設計考察上述6個待篩選的CPP，根據SMLHI生產過程的實際工藝確定各參數的操作范圍。各個參數的設定水平及篩選實驗的具體工藝條件參數見表1。此外，溶劑倍量會顯著影響提取效率，在相關研究中均被視作CPP。

表1 SMLHI水提工藝PB篩選實驗的參數水平和實驗條件

*括號中數字為各參數的相應水平

*numbers in parentheses were setting levels of parameters, respectively

2.4.2 CPP篩選實驗結果 篩選實驗樣品溶液中各組分的含量測定結果見表2，各工藝指標相應的回歸系數及權重系數見表3。由表3可知，6個酚酸模型的決定系數（2）均大于0.605，總固體與總糖模型的2大于0.663，各個指標的回歸模型均能描述工藝參數對指標的大部分影響。

水提工藝各影響酚酸提取效率的潛在CPP（1～6）的原始及調整后回歸系數絕對值之和分別為0.262、0.065、0.170、2.404、0.000、0.000與0.071、0.018、0.047、7.539、0.000、0.000。說明藥材中丹酚酸B含量、加熱溫度和保溫時間3個參數調整后的回歸系數絕對值之和大于其他工藝參數，即這3個參數對水提工藝中各酚酸的提出率變化有較顯著的影響。此外，據表3可知，藥材規格可以顯著影響總固體和總糖的提出率。由于藥材中丹酚酸B的含量在實際生產中采購過程會予以控制，因此本研究不進一步進行考慮。綜上，最終選擇加熱溫度（1）、保溫時間（3）、藥材規格（5）和溶劑倍量（7）為需要優化指標。

2.5 CPP優化

2.5.1 基于裂區的D-最優實驗設計 在丹參提取工藝的實際操作中，無論是小試、中試還是商業規模下的試驗，對提取罐溫度進行實時調整都會影響實驗效率與溫控精度：首先，加熱器的實時加熱效率及溫度本身較難調整；同時，一旦對加熱器的加熱效率進行調整，如不經過一段較長的等待時間，后續實驗的升溫曲線也會隨之發生變化。此外，這樣的變更也會極大增加時間成本與經費成本。因此，本實驗采用基于裂區的D-最優實驗設計，將加熱溫度設為困難因子（hard-to-change factor，HTCF），保溫時間、藥材規格和溶劑用量（以倍量表示）設為易于改變因子（easy-to-change factor，ETCF），各工藝參數的水平設定與實驗設計見表4。

表2 SMLHI水提工藝的PB篩選實驗結果

表3 SMLHI水提工藝的PB實驗各評價指標多元線性回歸模型的R2、回歸系數及指標的權重系數

“/”代表該工藝對模型影響不顯著

“/” the slash represents the corresponding item with no significance

2.5.2 優化實驗的CQA選擇 本研究基于SMLHI實際生產情況和《中國藥典》要求，在優化實驗中對CQA進行了適當的調整。藥典規定，SMLHI中的主要藥效成分為鹽酸川芎嗪與丹參素。丹參藥材中成分主要為丹酚酸B、丹參素等酚酸主要是由丹酚酸B經過一系列降解反應后產生[31-32]。因此，基于對丹酚酸B降解路徑的分析，本實驗將紫草酸、丹酚酸A及丹參素折算成相應丹酚酸B物質的量，以四者物質的量的總和視作酚酸提出量，以該指標來綜合評價酚酸類成分的提取規律。此外，考慮到雜質成分含量差異會影響提取液的物性參數以及后續純化工藝，因此，選取總酚酸純度（總酚酸純度＝酚酸提出量/總固體提出量）評價提取液質量?；谝陨暇C合考慮，選擇酚酸提出率、總酚酸純度、迷迭香酸提出率、總糖提出率和總固體提出率作為優化工藝的CQA。

2.5.3 優化實驗結果 優化實驗結果見表4。

（1）RSM模型：根據表4，采用Design-Expert軟件建立多指標優化模型，經顯著性分析，得到模型的回歸系數、2及值見表5。從表5可知，各CQA模型2均大于0.75，調整2均大于0.68，表明模型能解釋絕大部分變異。其中，加熱溫度對各個指標影響都不顯著，對比篩選實驗結果，加熱溫度的不同主要影響的是酚酸類成分組成。可能原因是加熱溫度不同對丹酚酸B降解存在一定程度的影響。提取時間和溶劑倍量對各成分提出率的相關系數都為正值，說明隨著提取時間和溶劑用量增加各成分提出率都能增大，但延長提取時間會降低總酚酸純度。藥材規格對各成分提出率的相關系數均為負值，說明藥材粉碎程度越大，各成分越容易提取出。實驗結果與提取傳質規律相吻合，溶劑倍量的增大，可以提高藥材內外濃度差，增加傳質推動力；藥材規格越大，即藥材比表面積越小，傳質阻力就越大[33]。

表4 水提工藝裂區D-優化實驗參數水平設定及結果

*參數的相應水平

*numbers in parentheses were setting levels of parameters, respectively

表5 水提工藝優化實驗設計各評價指標RSM模型的回歸系數、R2和調整后R2

&相應項的值

&numbers in parentheses werelevels of parameters, respectively

（2）RBF模型：BRF模型隱含層節點個數太少模型會欠擬合，而節點個數過多會造成過擬合，因此對隱含層節點數進行了優化。隨機選取優化實驗設計中28組作為校正集，7組作為驗證集，各指標模型的2和交叉驗證均方根誤差（root mean square error of cross validation，RMSECV）隨節點個數的變化趨勢如圖2所示。

依據圖2結果，最終選擇酚酸提出率、迷迭香酸提出率、總糖提出率、總固提出率和總酚酸純度RBF模型的隱含層節點個數依次為12、11、6、10、14，并用7組驗證集實驗對訓練好的RBF模型進行外部驗證，結果如表6所示。

從表6中可以發現，單克藥材中的酚酸提出率、迷迭香酸提出率、總糖提出率、總固體提出率RBF模型外部驗證均方根誤差（root mean square error of prediction，RMSEP）依次為0.260 6%、0.013 1%、4.859 4%、2.861 5%，總酚酸純度外部驗證均方根誤差為0.419 3%，結果均較好，表明RBF可以較好的應用于丹參水提過程的設計建模分析，且具有良好的預測性能。

表6 RBF模型性能評估結果

2.5.4 RSM和RBF模型比較 本研究以2和MRE為模型質量評價指標對2種模型進行比較分析。28組校正集的RSM和RBF模型預測值和實測值關系見圖3，各指標模型的2和預測MRE見表7。容易發現，除了總糖提出率模型2較RSM模型較差以外，RBF模型性能均較優于RSM模型。因此，本研究在所建RBF模型的基礎上進行后續多指標優化。

表7 水提工藝的RSM和RBF模型的R2和MRE

“*”處相應指標代表模型具有較好的預測性能

Indexes with “*” in the table represented better model performances

2.6 基于滿意度函數的最佳操作條件確定

根據生產情況和經驗，設定酚酸提出率、迷迭香酸提出率、總酚酸純度需要滿足的最小值以及總糖提出率、總固提出率需要滿足的最大值，并計算在操作范圍內各指標能達到的最大值或最小值。在本研究中，為了保證產品藥效活性，賦予有效成分較大權重。各指標設定的最值、權重、滿意度計算公式見表8，在此基礎上，計算RBF模型的SMLHI水提工藝最佳操作條件。具有最佳滿意度的操作參數為加熱溫度150 ℃，保溫時間84 min，藥材規格11 cm，溶劑倍量為10；滿意度為0.595 9。

表8 水提工藝CQA范圍及權重

max、min分別為計算所得操作范圍內指標能達到的最大值、最小值

max,minmeans the maximum and minimum value that an index could achieve

3 討論

本研究在QbD理念的指導下，系統地考察了SMLHI生產過程的丹參水提工藝。首先，通過PB實驗設計及加權回歸系數法篩選出了影響丹參水提的CPP。接著，為了提高實驗效率與操作精度，采用基于裂區D-最優實驗設計法進行了優化實驗設計，并通過RSM、RBF 2種建模方法建立了CPP和CQA間的定量關系，2種模型的考察結果均較好。與RSM模型相比，訓練所得的BRF模型整體性能較優，表明即使在數據量較小、實驗運行次數有限的情況下，ANN也能表現出較好的擬合和預測能力。但是，RSM模型較ANN模型能夠更加直觀的表達工藝參數對指標的影響。最后，本研究使用多指標優化算法綜合考察了丹參提取液質量，并基于較優的ANN模型確定了SMLHI水提工藝最佳的生產條件。

傳統的中藥制藥過程工藝優化研究過程中，當工藝參數的改動受限或更改成本高昂時，為充分發掘因子間的交互作用，需要引入特定的研究方法。本研究在實驗設計過程中利用了基于裂區設計的優化方法，有效避免研究工作中工藝參數的改動受限，通過該設計方法得到合理的實驗方案，有助于在降低研究成本的同時仍能對過程實現精準優化。此外，本研究將實驗設計與ANN、多指標優化算法相結合，更好的建立了SMLHI提取工藝CPP和CQA之間的關系，并確定了丹參水提液質量最優的生產條件。本研究能夠幫助提高研究效率并降低研究成本，對不同試驗規模下中藥制藥工藝的過程研究具有較大參考價值，為中藥制藥工藝的研究與二次開發提供了新的參考方法。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Optimization of water extraction process ofand Ligustrazine Hydrochloride Injection via split-plot based D-optimal experimental design

ZHAO Fang1, CHEN Ze-qi1, LI Wen-zhu1, GOU Wei2, LIU Fei2, ZHANG Cheng-yi2, QU Hai-bin1

1. Pharmaceutical Informatics Institute, Zhejiang University, Hangzhou 310058, China 2. Guizhou Baite Pharmaceutical Co., Ltd., Guiyang 550008, China

Quality by design (QbD) concept was applied to guide the efficient optimization of the water extraction process forand Ligustrazine Hydrochloride Injection (SMLHI).Firstly, Plackett-Burman experimental design method was used to screen critical process parameters (CPPs). Secondly, in order to improve the study efficiency, split-plot based D-optimal methodology was applied to implement experimental design. To obtain more process information, response surface method (RSM) and artificial neural network (ANN) were used to establish the regression model between CPPs and critical quality attributes (CQAs) for the extraction. Finally, after comparison of the two models, the optimum operating conditions were determined with the multi-index optimization algorithm by a better regression model.The study efficiency was improved by the split-plot method to conduct the experimental arrangement. Then, the ANN method showed better modeling performance than the RSM in this study, and then it was taken as the final optimum model for the multi-index optimization. The optimal operating conditions of the extraction process for SMLHI were follows: The heating temperature was 150 ℃, extraction time was 84 min, specification of medicinal material was 11 cm, and the ratio of material to water was 10.This study optimized the water extraction process for SMLHI by introducing the split-plot design into the process optimization of traditional Chinese medicine. Split-plot design methodology can provide reasonable experimental design solutions to improve research efficiency and reduce research costs for pharmaceutical process research in traditional Chinese medicine, which faces limited changes in process parameters and high costs. And it has a greater reference value for the process study of Chinese medicine pharmaceutical process under different test scale, and provides a new method for the secondary development of Chinese medicine pharmaceutical process for reference.

quality by design; split-plot design; response surface methodology; artificial neural network;and Ligustrazine Hydrochloride Injection; water extraction process; multi-index optimization; critical process parameter; D-optimal design; critical material attribute; satisfactory function

R284.1

A

0253 - 2670(2021)01 - 0045 - 10

10.7501/j.issn.0253-2670.2021.01.007

2020-09-07

國家“重大新藥創制”科技重大專項（2018ZX09201011-002）

趙 芳，女，博士研究生，研究方向為中藥制藥工藝研究。E-mail: z_fang@zju.edu.cn

瞿海斌，博士生導師，教授，從事中藥制藥過程質量控制研究。Tel: (0571)88208428 E-mail: quhb@zju.edu.cn

[責任編輯 鄭禮勝]