血管平滑肌細(xì)胞泡沫化進(jìn)程差異LncRNA 的篩選與分析

黃 艷 馮 習(xí)黃方舟 胡 亮

湖南省長(zhǎng)沙市第四醫(yī)院急診科，湖南長(zhǎng)沙 410006

動(dòng)脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）是冠心病、急性心肌梗死等疾病發(fā)生發(fā)展的病理基礎(chǔ)，約70%的急性冠狀動(dòng)脈事件是由易損斑塊所致[1]。近年來(lái)，各種高危因素導(dǎo)致急性心肌梗死等心血管疾病的發(fā)病率越來(lái)越高，發(fā)病年齡越來(lái)越年輕化，AS 的相關(guān)研究也成為當(dāng)前研究熱點(diǎn)。研究表明，血管壁內(nèi)多種細(xì)胞在刺激因素的作用下引起的功能失調(diào)或激活是粥樣斑塊的病理基礎(chǔ)[2]，如激活的血管平滑肌細(xì)胞（VSMCs）對(duì)粥樣斑塊的形成和穩(wěn)定性有重要作用[3]。因此，深入研究影響AS 斑塊穩(wěn)定性的因素及其機(jī)制，尋找穩(wěn)定斑塊、預(yù)防斑塊破裂的策略和方法，通過(guò)早期診斷和積極有效地干預(yù)，對(duì)降低AS 相關(guān)疾病的致殘致死率有至關(guān)重要的研究意義。

長(zhǎng)鏈非編碼RNA（long nocoding RNAs，LncRNAs）是一類(lèi)長(zhǎng)度大于200 個(gè)核苷酸、缺少蛋白質(zhì)編碼功能的長(zhǎng)鏈非編碼RNA，在發(fā)現(xiàn)之初被當(dāng)做是基因組內(nèi)的“噪音”[4]。研究發(fā)現(xiàn)人體內(nèi)存在眾多的LncRNA與心血管系統(tǒng)疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[5]。利用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)（RNA-seq）對(duì)組織或細(xì)胞中提取的全部RNA 進(jìn)行測(cè)序，進(jìn)而獲取組織或細(xì)胞在某一特定狀態(tài)下基因表達(dá)轉(zhuǎn)錄本的全面信息[6]，從中篩選對(duì)AS 病情進(jìn)展有預(yù)示作用的LncRNA 作為疾病標(biāo)志物[7]，可為深入研究LncRNA在AS 病情進(jìn)展中的功能和作用機(jī)制提供線索[8]。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的與AS 相關(guān)的LncRNA包括RAPIA[9]、NORAD[10]、TUG1[11]、ANRIL[12]等。

鑒于VSMCs 與LncRNAs 對(duì)于AS 的重要意義[13]，尋找VSMCs 泡沫化進(jìn)程差異表達(dá)LncRNA，能為研究AS 相關(guān)疾病的發(fā)生發(fā)展提供重要線索。但是目前的研究大部分還是處于起步階段，本研究對(duì)VSMC 沫化進(jìn)程中差異LncRNAs 進(jìn)行篩選，并對(duì)其功能進(jìn)行了分析和討論。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞及分組

家兔VSMC：細(xì)胞來(lái)源于湘雅細(xì)胞庫(kù)；實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞：經(jīng)氧化低密度脂蛋白（ox-LDL）處理24 h，濃度為80 μg/mL；對(duì)照組細(xì)胞未經(jīng)ox-LDL 刺激。實(shí)驗(yàn)組編碼為OX1、OX2、OX3、OX4，對(duì)照組編碼為：C1、C2、C3、C4。

1.2 方法與步驟

1.2.1 VSMC 的培養(yǎng)、凍存與復(fù)蘇

從液氮罐中取出凍存的細(xì)胞，迅速放入37℃恒溫水浴箱中，并不時(shí)地?fù)u動(dòng)凍存管，加快其融解。1000 r/min，r=13.5 cm，離心5 min，棄除上清。加入新鮮RPMI-1640 完全培養(yǎng)基（加10%胎牛血清）重懸細(xì)胞，轉(zhuǎn)移至25 mL 的培養(yǎng)瓶培養(yǎng)，做好標(biāo)記。細(xì)胞培養(yǎng)的條件為95%的空氣混合5%的二氧化碳，溫度為37°C。據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)情況，每天或者隔天更換新鮮培養(yǎng)基。以1∶2傳代培養(yǎng)2～3 代后，將生長(zhǎng)良好且存活率高的細(xì)胞適當(dāng)凍存留種，以備后續(xù)實(shí)驗(yàn)補(bǔ)充需要，凍存方法如下：a.選擇處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，去細(xì)胞培養(yǎng)液，用0.25%胰蛋白酶消化；b.用吸管吸取培養(yǎng)液反復(fù)吹打瓶壁上的細(xì)胞，使其成為均勻分散的細(xì)胞懸液，將細(xì)胞收集于離心管中離心（1000 r/min，r=13.5 cm，10 min）。c.去上清液，加20%小牛血清的完全培養(yǎng)基，4℃預(yù)冷15 min，逐滴加入無(wú)菌甘油，用吸管輕輕吹打使細(xì)胞均勻。d.分裝于安瓿中，火焰噴燈上封口。記錄日期、細(xì)胞種類(lèi)、凍存數(shù)量。e.裝入布袋；置于液氮罐頸口處存放過(guò)夜，次日轉(zhuǎn)入液氮中。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)組處理及油紅O 染色

實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞處理：濃度為80 μg/ml ox-LDL 刺激24 h（oxLDL 購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司，貨號(hào)：H7950）。油紅O 染色：收集兩組細(xì)胞，PBS 離心洗滌2 次，70%乙醇固定細(xì)胞20 min，制備細(xì)胞鋪片，PBS洗3 次，油紅O 染色20 min，蒸餾水沖洗，蘇木精染色20 s，氨水分色30 s，自來(lái)水洗返藍(lán)，PVP 封片，顯微鏡下觀察攝片。

1.2.3 RNA 的提取與質(zhì)量分析

（1）收集生長(zhǎng)良好的VSMC，1000 r/min，r=13.5 cm，離心5 min。

（2）Trizol 法提取RNA。①將實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組每管加入500 μL 的TRIzol，然后漩渦震蕩30 s，室溫靜置10 min，以致核酸蛋白復(fù)合物完全分離開(kāi)。②在4℃條件下，12 000 r/min（r=13.5 cm）離心15 min，取上清液，然后轉(zhuǎn)入另一批新高壓滅菌離心管內(nèi)。每管加入200 μL 氯仿，上下顛倒15 s，室溫靜置7 min。③在4℃條件下，12 000 r/min（r=13.5 cm）離心15 min，樣品被分為3 層（RNA 大部分溶解在上層的水相當(dāng)中），將上層水相轉(zhuǎn)移到新的離心管中。④向離心管中加入500 μL 異丙醇，上下顛倒15 s，室溫靜置7 min。在4℃條件下12 000 r/min（r=13.5 cm）離心15 min，棄上清，見(jiàn)RNA 沉于管底。⑤向管中加即時(shí)配置的75%乙醇500 μL，上下顛倒15 s，在4℃條件下12 000 r/min（r=13.5 cm）離心10 min，棄上清。⑥向管中加入新配置的75%乙醇500 μL，上下顛倒15 s，在4℃條件下12 000 r/min（r=13.5 cm）離心8 min，棄上清。⑦在4℃條件下8000 r/min（r=13.5 cm）離心2 min，用小Tip頭吸除剩余的水分，室溫靜置7 min，使乙醇揮發(fā)。⑧向沉淀的RNA 中加40 μL 0.1% DEPC，接著放入65℃水浴箱中水浴5 min 以溶解RNA。⑨Nanodrop 檢測(cè)提取的RNA 的濃度和純度（OD260/280比值）。

從樣本中提取高質(zhì)量的RNA 后，寄往北京諾禾致源生物信息科技有限公司進(jìn)行LncRNA 測(cè)序分析。

1.2.4 高通量測(cè)序（RNA-seq）

選取8 個(gè)樣品寄往北京諾禾致源生物信息科技有限公司進(jìn)行基因測(cè)序；測(cè)序流程大致為樣品檢測(cè)、rRNA 去除、雙鏈cDNA 合成、末端修復(fù)、加測(cè)序接頭、片段選擇、降解cDNA 第二鏈、PCR 富集、文庫(kù)質(zhì)檢、上機(jī)測(cè)序。

1.2.5 差異表達(dá)LncRNA 篩選及靶基因預(yù)測(cè)

1.2.5.1 候選LncRNA 篩選 基本篩選、編碼潛能篩選基本篩選：step 1：對(duì)所有樣品拼接得到的轉(zhuǎn)錄本使用cuffcompare 軟件進(jìn)行合并，選擇同時(shí)被兩種拼接軟件拼接到，或者同時(shí)出現(xiàn)在至少兩個(gè)樣品中的轉(zhuǎn)錄本；step 2： 選擇轉(zhuǎn)錄本長(zhǎng)度≥200 bp，Exon 個(gè)數(shù)≥2 個(gè)的轉(zhuǎn)錄本；step 3： 通過(guò)cufflinks 計(jì)算每條轉(zhuǎn)錄本的reads 覆蓋度，選擇覆蓋度≥3 的轉(zhuǎn)錄本；step 4：通過(guò)cuffcompare 軟件，將前一步得到的轉(zhuǎn)錄本與已知LncRNA 進(jìn)行比較，得到與已知LncRNA 相同的轉(zhuǎn)錄本。step 5：利用cuffcompare 分析結(jié)果中的class_code信息篩選候選LncRNA 轉(zhuǎn)錄本。

編碼潛能篩選：具有編碼潛能與否是判斷轉(zhuǎn)錄本是否為L(zhǎng)ncRNA 的關(guān)鍵條件，使用CPC 分析、CNCI分析、pfam 蛋白結(jié)構(gòu)域分析和PhyloCSF 分析結(jié)果的交集作為本研究分析預(yù)測(cè)得到的LncRNA 數(shù)據(jù)集。

1.2.5.2 靶基因預(yù)測(cè) 預(yù)測(cè)原理：cis 作用靶基因預(yù)測(cè)基本原理是LncRNA 的功能與其坐標(biāo)臨近的蛋白編碼基因相關(guān)，篩選LncRNA 臨近位置的（上下游100 kb）蛋白編碼基因作為其靶基因。trans 作用靶基因預(yù)測(cè)基本原理是LncRNA 的功能不依賴(lài)于和編碼基因的位置關(guān)系，而與其共表達(dá)的蛋白編碼基因相關(guān)。可以通過(guò)樣本間LncRNA 與蛋白編碼基因的表達(dá)量相關(guān)性分析或共表達(dá)分析方法來(lái)預(yù)測(cè)其靶基因。

1.2.6 差異表達(dá)LncRNA 靶基因富集與功能預(yù)測(cè)

1.2.6.1 KEGG 與GO 富集分析 Gene Ontology 是基因功能?chē)?guó)際標(biāo)準(zhǔn)分類(lèi)體系。根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮Y選特異基因后，研究這些基因在Gene Ontology 中的分布狀況將闡明實(shí)驗(yàn)中樣本差異在基因功能上的體現(xiàn)。

KEGG 是有關(guān)Pathway 的主要公共數(shù)據(jù)庫(kù)。在生物體內(nèi)，不同基因相互協(xié)調(diào)行使其生物學(xué)功能，通過(guò)Pathway 顯著性富集能確定特異基因參與的最主要生化代謝途徑和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。

1.2.6.2 malacard 數(shù)據(jù)整理 在malacard 數(shù)據(jù)庫(kù)查找動(dòng)脈粥樣硬化相關(guān)疾病，例如冠心病等。查找排列前20 位的AS 相關(guān)疾病的靶基因，數(shù)量總計(jì)1944 個(gè)。統(tǒng)計(jì)高通測(cè)序結(jié)果中反式作用靶基因，共計(jì)56 458 個(gè)。將上述兩個(gè)表格中的數(shù)據(jù)在Excel 表格中利用重復(fù)項(xiàng)篩選工具進(jìn)行篩選，共計(jì)重復(fù)靶基因數(shù)量為143 個(gè)，這些靶基因即為測(cè)序結(jié)果中可能與AS 相關(guān)的靶基因。

1.2.7 人同源LncRNA 比對(duì)與篩選

①28 個(gè)差異表達(dá)的LncRNA 中篩選出7 個(gè)顯著上調(diào)LncRNA 和5 個(gè)顯著下調(diào)LncRNA；篩選標(biāo)準(zhǔn)為：log2（foldchange）絕對(duì)值＞1，P ＜0.05。

②通過(guò)ensembl 數(shù)據(jù)庫(kù)中Blat Tool 對(duì)12 個(gè)差異表達(dá)顯著的LncRNA 進(jìn)行同源性對(duì)比參數(shù)設(shè)置方法：輸入LncRNA 序列，參考數(shù)據(jù)庫(kù)選擇非編碼RNA 數(shù)據(jù)庫(kù)，比對(duì)物種為人，搜索敏感度選擇遠(yuǎn)系同源，Evalue 值選擇1e-4，比對(duì)長(zhǎng)度＞100 bp，選取同源性較好的LncRNA。

2 結(jié)果

2.1 油紅O 染色

顯微鏡下實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞內(nèi)觀察到大量紅色脂滴，對(duì)照組未發(fā)現(xiàn)明顯紅色脂滴，提示ox-LDL 孵育有效。染色結(jié)果見(jiàn)圖1（封四）。

2.2 RNA 質(zhì)檢及測(cè)序原始數(shù)據(jù)質(zhì)量評(píng)價(jià)

Nanodrop 檢測(cè)RNA 的濃度和純度 （OD260/280比值）。經(jīng)Nanodrop 檢測(cè)RNA 的濃度達(dá)1000 ng/μL 以上，OD260/280比值在1.90～2.00 之間。

Agilent 2100 檢測(cè)結(jié)果如表1 所示；高通量測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)量評(píng)估如表2 所示（委托京諾禾致源生物信息科技有限公司完成）。

表1 Agilent 2100 檢測(cè)結(jié)果

表2 測(cè)序質(zhì)量評(píng)估統(tǒng)計(jì)

2.3 差異表達(dá)LncRNA 篩選及靶基因預(yù)測(cè)結(jié)果

基本篩選：通過(guò)方法中描述的5 個(gè)步驟，每個(gè)步驟根據(jù)要求保留符合要求的轉(zhuǎn)錄本，最后保留3629 個(gè)轉(zhuǎn)錄本。見(jiàn)圖2。

圖2 基本篩選結(jié)果展示圖（橫坐標(biāo)5 個(gè)步驟見(jiàn)詳見(jiàn)方法）

編碼潛能篩選：具有編碼潛能與否是判斷轉(zhuǎn)錄本是否為L(zhǎng)ncRNA 的關(guān)鍵條件，通過(guò)CPC 分析、CNCI分析、pfam 蛋白結(jié)構(gòu)域分析和PhyloCSF 分析分別得到各自保留的轉(zhuǎn)錄本，然后通過(guò)區(qū)交集區(qū)域共獲得2037 個(gè)無(wú)編碼潛能差異轉(zhuǎn)錄本。見(jiàn)圖3。

圖3 編碼潛能篩選結(jié)果維恩圖

篩選結(jié)果如下：①差異轉(zhuǎn)錄本共計(jì)506 個(gè)，部分?jǐn)?shù)據(jù)見(jiàn)表2；其中LncRNA 轉(zhuǎn)錄本28 個(gè)，novel 轉(zhuǎn)錄本30，mRNA 轉(zhuǎn)錄本448 個(gè)。②448 個(gè)mRNA 轉(zhuǎn)錄本來(lái)自446 個(gè)編碼基因，絕大部分由已知編碼基因生產(chǎn)。③28 個(gè)LncRNA 轉(zhuǎn)錄本來(lái)自28 個(gè)編碼基因，編碼基因均未知。④30 個(gè)novel 轉(zhuǎn)錄本來(lái)自30 個(gè)編碼基因。⑤3 種轉(zhuǎn)錄本的編碼基因沒(méi)有交集。

統(tǒng)計(jì)學(xué)篩選：篩選標(biāo)準(zhǔn)為log2（fold change）絕對(duì)值＞1，P ＜0.05。能滿足P ＜0.05 的轉(zhuǎn)錄本數(shù)目為28 個(gè)，同時(shí)滿足兩個(gè)條件的為12 個(gè)。實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組比較，其中7 個(gè)為表達(dá)顯著上調(diào)的轉(zhuǎn)錄本，5 個(gè)為表達(dá)顯著下調(diào)的轉(zhuǎn)錄本。見(jiàn)表3。

表3 28 個(gè)差異表達(dá)轉(zhuǎn)錄本

2.4 差異表達(dá)LncRNA 靶基因富集結(jié)果

2.4.1 功能預(yù)測(cè)

對(duì)差異表達(dá)轉(zhuǎn)錄本靶基因KEGG 富集分析得到如下結(jié)果，Trans 靶基因的KEGG 的聚類(lèi)結(jié)果顯示236 條靶基因富集到的通路中，其中Steroid biosynthesis、Selenocompoundmetabolism、Fattyacidmetabolism、HIF-1 signaling pathway、Glycolysis/Gluconeogenesis 等信號(hào)通路出現(xiàn)了富集差異，主要涉及細(xì)胞內(nèi)脂類(lèi)代謝、合成以及低氧應(yīng)激等活性。見(jiàn)圖4（封四）。

差異表達(dá)基因GO 富集分析如圖5（封四）顯示，Trans 作用涉及到10 867 個(gè)靶基因。富集term 中處理組與對(duì)照組在response to stress、cell death、death、pro grammed cell death、apoptotic process、intracellular 等細(xì)胞功能相關(guān)的靶基因上出現(xiàn)顯著富集差異。其他term 主要涉及細(xì)胞內(nèi)代謝合成等相關(guān)基因。

2.4.2 Malacard 數(shù)據(jù)整理

對(duì)高通量測(cè)序的LncRNA 轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行靶基因預(yù)測(cè)，共得到56 458 個(gè)靶基因。在malacard 數(shù)據(jù)庫(kù)中以AS 關(guān)聯(lián)的20 種臨床疾病（心肌梗死、頸動(dòng)脈閉塞、缺血性心臟病、冠心病等）為關(guān)鍵詞進(jìn)行搜索，共得到1944 個(gè)AS 相關(guān)基因，通過(guò)Venn 圖計(jì)算獲取預(yù)測(cè)靶基因與malacard 中收錄AS 相關(guān)基因的交集，其中143 個(gè)基因?yàn)楸敬胃咄繙y(cè)序結(jié)果中LncRNA 對(duì)應(yīng)的靶基因。見(jiàn)圖6。

圖6 malacard 靶基因預(yù)測(cè)維恩圖

AS 相關(guān)疾病關(guān)聯(lián)基因的交集結(jié)果：GATA4、ANXA5、SOD1、FGB、ITGAM、F7、ABCG8、HFE、PLAT、APOA4、FGA、ANKRD1、PCSK9、PTGS1、CA3、CXCL11、AGTR2、APOA5、ACTA2、EDN1、PAPPA、ACVRL1、PPARG、MGP、HMGCR、GCLM、PGF、HIF1A、PPIG、MKKS、FGF2、LRP6、ANGPT1、CHD7、BMPR2、SETD2、LMNA、MMP2、ADRB1、NOS3、HMOX1、OLR1、PON2、PALLD、HAND2、CKM、CXCL10、CAT、ADRB2、FN1、CA4、PTPN11、ADIPOQ、FABP3、VEGFA、GP1BA、TTN、CCT7、RYR2、F5、ACTC1、NPPC、SERPINC1、PLA2G7、WRN、CAMK2G、HTR2A、ABCA1、VCAM1、TNNT2、F11、NKX2-6、ADAMTS18、DSCAM、POSTN、LTA、PSEN1、CCL5、CASP3、APOB、PDE5A、NOS2、CCL2、SELE、SCN5A、TBX20、ESR1、SORT1、PPARD、ICAM1、DCN、CDH5、MTRR、SERPINE1、SELL、PHACTR1、PIK3C2A、NAMPT、GCLC、CSF1、CST3、SERPINF2、F3、IRAK4、GUCY1A3、TGFB1、LIPC、CD14、HP、MEF2A、GJA1、DSG2、MSR1、GATA6、PSMA6、TAZ、BGN、COG2、ADAMTS13、APOH、LRP8、PROCR、MMP1、NPY、PON1、LPL、IL10、SETD1A、CIITA、CXCR4、IL6、SLC39A2、MME、NR3C2、CEL、PIGL、ADD1、SELP、APOA2、ADM、MAP2、TIMP1。

2.5 人同源LncRNA 比對(duì)與篩選結(jié)果

通過(guò)ensemble 數(shù)據(jù)庫(kù)分別對(duì)12 個(gè)差異表達(dá)顯著的LncRNA 進(jìn)行同源性對(duì)比，排除沒(méi)有比對(duì)結(jié)果的LncRNA，選取同源性較好的6 個(gè)LncRNA（ID 值＞80%）。見(jiàn)表4。

表4 人同源LncRNA 比對(duì)與篩選結(jié)果

3 討論

本研究收集泡沫化進(jìn)程的VSMC，經(jīng)過(guò)RNA 測(cè)序獲得原始序列數(shù)據(jù)、通過(guò)生物信息學(xué)分析及統(tǒng)計(jì)學(xué)分析得到28 個(gè)差異顯著的轉(zhuǎn)錄本，本其中LncRNA全部為首次報(bào)道的新轉(zhuǎn)錄本。通過(guò)對(duì)28 條差異表達(dá)LncRNA 轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行功能注釋和數(shù)據(jù)庫(kù)聯(lián)合分析，發(fā)現(xiàn)這些LncRNA 與AS 疾病存在密切關(guān)系。

AS 是最常見(jiàn)的心腦血管系統(tǒng)疾病之一。根據(jù)世界衛(wèi)生組織WHO 調(diào)查數(shù)據(jù)，每年全世界有800～1000 萬(wàn)人因動(dòng)脈硬化所引起的急性心腦血管疾病死亡，AS已成為影響全人類(lèi)健康的頭號(hào)殺手[14]。AS 的主要病理變化是以動(dòng)脈管壁脂質(zhì)沉積、內(nèi)膜增生、炎性浸潤(rùn)和粥樣斑塊形成及鈣化為主[15-16]。在構(gòu)成血管壁的多種細(xì)胞中，VSMCs 的增殖和遷移在AS 的發(fā)展中起著重要作用[17]，是引起血管損傷和再狹窄的一個(gè)關(guān)鍵因素。AS 發(fā)展之初，VSMCs 從收縮型變?yōu)楹铣尚停疫w移到血管內(nèi)膜，從而導(dǎo)致內(nèi)膜增生[18]。研究結(jié)果顯示，ox-LDL 能通過(guò)上調(diào)骨橋蛋白（osteopontin，OPN）表達(dá)量來(lái)影響VSMCs 的增殖和遷移，并表現(xiàn)為劑量依賴(lài)性[19]。在AS 形成過(guò)程中，VSMCs 受ox-LDL 刺激由收縮型轉(zhuǎn)化為合成型[20-21]，并向血管中膜遷移，在增殖的過(guò)程中分泌細(xì)胞外基質(zhì)并聚集在病灶部位，從而致使血管內(nèi)膜上纖維帽形成。這種由ox-LDL 介導(dǎo)的VSMCs 增殖、遷移、凋亡等一系列細(xì)胞活動(dòng)能夠促進(jìn)粥樣斑塊的形成與發(fā)展，與AS 相關(guān)的血管病理改變密切相關(guān)[23]。

因此，研究VSMCs 在致病因素刺激下細(xì)胞狀態(tài)、細(xì)胞活動(dòng)以及相應(yīng)細(xì)胞成分的改變對(duì)于揭示AS 發(fā)生發(fā)展，以及為AS 尋找新的治療和檢測(cè)靶點(diǎn)具有重要意義。以RNA-seq 技術(shù)為代表的二代測(cè)序技術(shù)已成為基因表達(dá)和轉(zhuǎn)錄組分析的常用研究手段[24]，近兩年三代全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序也已經(jīng)開(kāi)始應(yīng)用在轉(zhuǎn)錄水平的測(cè)序任務(wù)，但目前無(wú)論實(shí)驗(yàn)成本和樣本質(zhì)量要求都還無(wú)法達(dá)到快速普及的目的[25]。RNA-seq 技術(shù)能夠?qū)^大多數(shù)物種的整體轉(zhuǎn)錄活動(dòng)進(jìn)行檢測(cè)，通過(guò)將組織或細(xì)胞中總RNA 反轉(zhuǎn)錄為cDNA 進(jìn)行文庫(kù)構(gòu)建再進(jìn)行測(cè)序，統(tǒng)計(jì)所有轉(zhuǎn)錄本的reads 數(shù)來(lái)計(jì)算出不同RNA轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)量。在獲得轉(zhuǎn)錄本的序列特征和表達(dá)水平的同時(shí)，還能發(fā)掘新轉(zhuǎn)錄本和稀有轉(zhuǎn)錄本，識(shí)別可變剪切位點(diǎn)及序列的單核酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP），在轉(zhuǎn)錄水平為研究者提供全面的參考信息[26]。

Malacard 為人類(lèi)疾病基因數(shù)據(jù)庫(kù)，廣泛收錄了大量來(lái)自實(shí)驗(yàn)和預(yù)測(cè)得到的人類(lèi)基因信息。本研究中，靶基因預(yù)測(cè)結(jié)果與malacard 收錄基因合并分析結(jié)果表明，篩選得到的LncRNA 轉(zhuǎn)錄本與AS 存在密切關(guān)系。同時(shí)，進(jìn)一步檢索143 個(gè)靶基因所對(duì)應(yīng)的疾病種類(lèi)，主要包括病理性肥胖、心肌梗死、頸動(dòng)脈閉塞、先天性心臟病、頸動(dòng)脈疾病、缺血性心臟病、流行性乙型腦炎、角膜內(nèi)皮炎、冠心病等，這些疾病都是心腦血管疾病或者與AS 相關(guān)的疾病，進(jìn)一步證明本研究中實(shí)驗(yàn)組所采用的ox-LDL 處理方法和引起VSMCs 在LncRNA 表達(dá)水平上發(fā)生改變，提示這種變化可能與AS 的發(fā)生發(fā)展具有相關(guān)性。

本研究中篩選得到的差異表達(dá)LncRNA28 個(gè)，其中顯著表達(dá)差異者12 個(gè)，GO 和KEGG 數(shù)據(jù)庫(kù)聚類(lèi)分析結(jié)果顯示差異表達(dá)LncRNA 對(duì)應(yīng)的靶基因廣泛涉及脂類(lèi)代謝、合成，細(xì)胞凋亡、程序性死亡等生物學(xué)過(guò)程，這些過(guò)程都對(duì)AS 的發(fā)生發(fā)展都有重要作用。通過(guò)對(duì)ox-LDL 刺激的VSMC 測(cè)序分析得到28 個(gè)差異表達(dá)LncRNA，反式作用KEGG 富集分析得到3 個(gè)AS 相關(guān)通路：萜類(lèi)化合物支架生物合成、類(lèi)固醇生物合成、糖酵解和糖質(zhì)新生。他們從分子功能、細(xì)胞成分及各類(lèi)生物學(xué)過(guò)程均有富集。針對(duì)篩選出的差異LncRNAs，通過(guò)同源對(duì)比得到人源差異轉(zhuǎn)錄本及LncRNA信息，為下一步實(shí)驗(yàn)繼續(xù)研究其功能與作用機(jī)制，將可能為預(yù)防AS 的發(fā)生和控制相關(guān)疾病的進(jìn)展提供新的靶點(diǎn)。