斑馬魚在藥物毒理學評估中應用及機制的研究進展

李紅燕，謝 倩，王 成，李金秀，馬 榮，任敉宏，李 勇，王佳俊，陳 海，王 建

斑馬魚在藥物毒理學評估中應用及機制的研究進展

李紅燕，謝 倩，王 成，李金秀，馬 榮，任敉宏，李 勇，王佳俊，陳 海，王 建*

成都中醫藥大學藥學院，四川 成都 611137

與其他哺乳動物相比，斑馬魚具有繁殖能力強、繁殖量大、生命周期短、養殖費用低、身體透明等特點。主要從心血管毒性、肝臟毒性、腎臟毒性、神經毒性、脾臟毒性和急性毒性6個方面進行歸納總結，結果發現斑馬魚的多個器官在形態、基因表達及生理特性方面均與哺乳動物高度相似，已被廣泛應用于藥物的毒性物質篩選研究。藥物對斑馬魚毒性研究主要集中在死亡率和畸形率增加，心、肝、腎、脾等臟器形態、表型改變并伴有水腫及神經毒性等方面；其毒性機制主要涉及影響器官中細胞凋亡（p53通路）、炎癥（NF-κB通路、白介素）或影響該器官功能蛋白、酶或mRNA，如丙氨酸氨基轉移酶（ALT）、天冬氨酸氨基轉移酶（AST）、乙酰膽堿酯酶（AChE）、微球蛋白前體（）和α微管蛋白（α tubulin）等。斑馬魚模型可作為一種評估藥物安全性與毒性最為高效、快速、便捷的方法，闡明藥物的毒性作用及其多組分多靶點的毒性作用機制，可為藥物毒理學中的毒性評估提供新的思路。

斑馬魚；藥物毒理學；毒性評估；安全性評價；心血管毒性；肝臟毒性；腎臟毒性；神經毒性；脾臟毒性；急性毒性

斑馬魚俗稱為斑馬擔尼魚、藍條魚、印度魚，是一種原產于印度和孟加拉國的輻鰭亞綱鯉科熱帶硬骨魚，身上有數條可直達尾鰭的深藍色條紋，因其全身條紋形似斑馬紋而得名。斑馬魚是僅次于小鼠的第2大模型生物，其具有體積小，樣本量大，胚胎透明易于觀察，與人類基因同源性高和實驗周期短等優勢[1-3]，其胚胎、幼魚和成魚最早是被用來檢測水中的有毒物質和致畸物[4]。后來也用于環境污染物的毒性評價，如原油、農藥、重金屬、工廠污水和消毒副產物等對生態環境的毒性損害[5-7]。Streisinger等[8]于1981年首次將斑馬魚與遺傳學和生物學領域劃上聯系，使其研究領域得以拓展和延伸。目前，斑馬魚已被廣泛用于遺傳學、生態毒理學、藥物藥效活性物質篩選、藥物代謝、藥物毒性物質篩選等方面[9-11]。斑馬魚在藥物毒理學評估中的應用匯總如圖1所示。

提高藥物早期毒性預測的可靠性和靈敏度已成為新藥開發行業的迫切需求，而斑馬魚具有高通量的評價、檢測和篩選藥物毒性作用的獨特優勢，其作為藥物毒性與安全性評價的實驗動物受到醫藥學界越來越多的重視，已逐漸成為藥物研發過程中毒性評價和安全性評價的重要工具[12]。結合國內外文獻報道，本文綜述了斑馬魚作為新興模式生物在藥物毒理學評價方面的研究進展，主要從藥物心血管毒性、肝臟毒性、腎臟毒性、神經毒性、脾臟毒性和急性毒性6個方面及多組分多靶點的毒性作用機制進行歸納總結，以期為斑馬魚在藥物毒理學中的毒性評估提供新的思路。

圖1 斑馬魚在藥物毒理學評估中的應用

1 評估藥物的心血管毒性

1.1 斑馬魚評價心血管毒性的優勢

心血管毒性是藥物研發的主要限制因素[13]。斑馬魚的心血管系統是由心房、心室、靜脈竇和動脈球串聯而成[14]，其心臟發育是一個迅速但復雜的過程，胚胎在受精后5 h（hours post fertilization，hpf）時心臟前體細胞成型，22 hpf時心臟開始出現收縮動作，48 hpf時功能性瓣膜逐漸形成，心率趨于穩定，72 hpf時完成胚胎期心臟的發育。與此同時，斑馬魚在24 hpf時尾部由蜷縮狀態開始伸展，節間血管開始生長，到48 hpf時節間血管基本發育完全。有研究報道，斑馬魚心臟發育的形態、基因、生理特性以及血管生成過程均與哺乳動物相似[15-16]，可通過光學顯微鏡對其心臟、血管和血液流動狀態進行全程的監視，用于探究藥物對斑馬魚的心血管毒性作用，為篩選藥物的心血管毒性作用提供有效依據[17]。目前，在血管系統、血液、內皮細胞和心臟中表達熒光蛋白的轉基因系斑馬魚的可用性也有助于精確和準確地評價藥物對心血管系統的影響[18]。可見斑馬魚的上述優勢使其成為篩選藥物心血管毒性的重要生物模型。

1.2 藥物對心血管毒性的影響

傳統中藥中提取分離出的很多單體化合物具有明顯的藥理活性，可以作為新藥研發過程中的先導化合物，但是由于它們可能具有一些潛在的心血管毒性作用而限制了其臨床應用。何俊霖等[19]以2、4、8、10 μg/mL異甘草素處理正常斑馬魚胚胎10、24 h，結果顯示異甘草素質量濃度高于2 μg/mL可抑制斑馬魚胚胎血管生成，達8 μg/mL時，胚胎開始出現輕微血液瘀滯現象，且完全抑制尾部靜脈血管的生成。異甘草素處理12 h后，胚胎心率隨異甘草素質量濃度的升高而呈降低的趨勢，當質量濃度達到10 μg/mL時，對胚胎心率有持續性的抑制作用和誘發心臟畸形的作用，導致胚胎心包和卵黃囊腫大。這表明高劑量的異甘草素對斑馬魚的胚胎發育有較強的毒性作用。趙慧等[20]建立阿霉素誘導的轉基因Tg（∶）系心臟特異表達綠色熒光斑馬魚心肌損傷模型，結果顯示阿霉素30、40 μg/mL干預24、48 h后，胚胎生存率顯著降低，其活動受到抑制，心房、心室變大，出現不同程度的心包水腫，且動脈球間距顯著增大；病理染色結果也提示給藥后斑馬魚心臟明顯變大，且結構紊亂，有紅細胞溢出等。此外，氯化鋇、廣藿香、諾氟沙星、京大戟等對斑馬魚心血管發育生長也具有一定影響[21-27]。斑馬魚在藥物心血管毒性中的研究見表1。

1.3 藥物對斑馬魚心血管毒性的作用機制

趙慧等[20]通過阿霉素建立心肌損傷模型，通過DAPI和TUNEL染色發現阿霉素40 μg/mL組斑馬魚心臟明顯變大，細胞數目減少且較稀疏，細胞核增大，凋亡細胞增多，且阿霉素對斑馬魚胚胎的心肌損傷作用呈時間和濃度相關性。表明阿霉素誘導的斑馬魚心肌損傷模型是可靠的，且其機制可能與增加心肌細胞凋亡有關。王冬梅等[24]觀察了0、10、20、40 μmol/L諾氟沙星對斑馬魚胚胎不同發育時期脊柱彎曲、心包囊腫、卵黃囊腫和死亡率等毒性作用，結果顯示隨著諾氟沙星暴露濃度的增大，胚胎的發育延遲，孵化時間延長，胚胎死亡率增加；且暴露于不同濃度諾氟沙星的斑馬魚胚胎中基因表達隨發育時間延長而增加趨勢減緩。提示諾氟沙星的心臟毒性機制與基因相關。

表1 斑馬魚在藥物心血管毒性研究中的應用

TGF-β1-轉化生長因子-β1 LD50-半數致死量

TGF-β1-transforming growth factor-β1 LD50-median lethal dose

2 評估藥物的肝臟毒性

2.1 斑馬魚評估肝臟毒性的優勢

藥物性肝損傷已逐漸變成臨床醫學和新藥研發中的一個重大挑戰。因此，尋找新的模型來預測潛在治療藥物是否導致藥物性肝損傷迫在眉睫。研究表明，斑馬魚肝臟在28 hpf時開始發芽，在72 hpf時被血液灌流并具有生理功能，在肝臟的形成過程中，其通體透明，易于觀察[28-30]。有研究顯示，斑馬魚的器官、生長因子和基因的表達、肝細胞組成、功能、信號和對損傷的反應等方面與高等脊椎動物有很多相似之處[31-32]，使其成為檢測藥物肝毒性和研究其肝毒性機制的重要手段。將胚胎或幼魚暴露，通過觀察肝臟表型、特殊染色處理或生化指標檢測等手段，可直接或間接探究藥物對斑馬魚肝臟的影響。此外，采用肝臟熒光轉基因斑馬魚，如Tg（∶）、Tg（∶）等作為模型，是評價肝臟毒性的又一手段，通過斑馬魚整體圖像的分析技術，對肝臟面積大小和肝臟熒光強度進行綜合定量分析，快速、系統的評價藥物的肝臟毒性作用[33]。因此，斑馬魚作為藥物肝臟毒性篩選的模式生物，也具有重要的意義。

2.2 藥物對肝臟毒性的影響

段亞輝等[34]采用斑馬魚模型比較款冬花、葉的肝臟毒性，觀察款冬花和葉給藥后3 d對健康AB系及轉基因系斑馬魚肝、腎形態、肝臟的熒光面積、肝臟丙氨酸氨基轉移酶（alanine aminotransferase，ALT）、天冬氨酸氨基轉移酶（aspartate aminotransferase，AST），結果顯示款冬花和葉對斑馬魚肝臟生化指標無顯著影響，但款冬花1.5 mg/mL組斑馬魚肝臟熒光面積減小，提示款冬花對肝臟產生一定的毒性，款冬葉未表現出明顯的肝毒性。全云云等[35]首次用肝臟熒光轉基因斑馬魚Tg（∶）對何首烏中的18種成分進行了肝臟毒性研究，檢測斑馬魚肝臟表型、面積、熒光強度、肝體比和病理情況等指標，結果發現，何首烏肝毒性的物質基礎可能是由蒽醌類化合物介導，且以結合蒽醌為主，同時發現蘆薈大黃素和蘆薈大黃素-8--葡萄糖苷對斑馬魚體內ALT、AST、谷胱甘肽（glutathione，GSH）和總膽紅素（total bilirubin，TBIL）水平、肝臟組織病理等影響較大，可能是肝毒性主要物質基礎[36]。此外，吡嗪酰胺、香加皮、芫花等對斑馬魚肝臟毒性作用，也取得了一定的成果[37-40]。見表2。

表2 斑馬魚在藥物肝臟毒性研究中的應用

Caspase-3-半胱氨酸蛋白酶-3 Bax-Bcl-2關聯X蛋白 Bcl-2-B細胞CLL/淋巴瘤2 SOD-超氧化物歧化酶 ROS-活性氧 CAT-過氧化氫酶 MDA-丙二醛

Caspase-3-cysteine protease 3 Bax-Bcl-2-associated X protein Bcl-2-B-cell CLL/lymphoma 2 SOD-superoxide dismutase ROS-reactive oxygen species CAT-catalase MDA-malondialdehyde

2.3 藥物對斑馬魚肝臟毒性的作用機制

付曉春等[37]考察雷公藤多苷對斑馬魚肝臟損傷的表型及對肝細胞凋亡的影響，結果顯示雷公藤多苷383、417 g/mL時給藥24～48 h顯著性增加斑馬魚的卵黃囊面積、增加肝臟面積和延遲卵黃囊的吸收。雷公藤多苷42.5、128、383 g/mL連續給藥48 h后可觀察到斑馬魚肝細胞凋亡明顯增加，Caspase-3蛋白活性增加，促凋亡蛋白Bax的表達量顯著增加，但Caspase-9蛋白的活性以及基因的表達未見明顯改變。提示雷公藤多苷的肝毒性機制與Caspase-3蛋白激活，促肝細胞過度凋亡有關。Quan等[41]用Tg（∶）型斑馬魚研究蘆薈大黃素的肝毒性作用及其潛在的毒性機制，結果發現蘆薈大黃素的肝毒性機制與核因子κB（nuclear factor kappa-B，NF-κB）蛋白的炎癥通路和基因的凋亡通路的激活有關。

3 評估藥物的腎臟毒性

3.1 斑馬魚評估腎臟毒性的優勢

腎臟是人和高等動物主要的排泄器官，主要濾過血液中的雜質、維持體液和電解質的平衡、藥物代謝等，因此腎臟容易成為藥物毒性物質累積并引發急性損傷的靶器官。斑馬魚胚胎在24 hpf內形成，具有由2個腎單位組成的解剖學上簡單的腎上腺，其腎單位結構、功能和分子組成與人類腎臟高度相似[42-43]，具有排泄水和維持滲透的功能[44]，故近年來在腎臟發育和腎臟疾病研究中的應用進展有了巨大的增長[45-46]。滲透壓調節紊亂易損傷斑馬魚腎臟，使其腎臟出現不同程度的水腫、組織形態改變等，可通過顯微觀察或組織病理切片觀察腎臟異常，還可通過熒光顯微鏡觀察轉基因斑馬魚腎臟的熒光面積，評價腎臟損傷情況。快速、高通量篩選是斑馬魚作為腎臟毒性研究工具的重要優勢。

3.2 藥物對腎臟毒性的影響

Hentschel等[47]利用腎毒性藥物第1次成功地構建了斑馬魚急性腎損傷模型，在50、72 hpf的斑馬魚胚胎心臟靜脈竇內注射慶大霉素或順鉑引起嚴重的腎小管重吸收功能障礙。梁錦鋒等[48]利用斑馬魚模型評價注射用鹽酸萬古霉素和厄貝沙坦片的腎毒性，結果發現萬古霉素在注射劑量為16.4 ng/尾時，斑馬魚發育正常，未見明顯的毒性，注射劑量在54.7～273 ng/尾，有明顯的腎毒性。厄貝沙坦在8.3～91 μg/mL時，斑馬魚腎臟均發育正常，未見腎毒性。此外，也有關于中藥對斑馬魚腎毒性的相關研究。研究表明，款冬花和款冬葉中含有毒性物質吡咯里西丁生物堿[49]。段亞輝等[34]通過款冬花和葉給藥后3 d對健康AB系及轉基因系斑馬魚的腎形態、表型和培養液蛋白量水平進行觀察，評價藥物腎臟毒性，結果顯示各給藥組斑馬魚形態無明顯的改變，全身或局部未出現水腫，培養液上清中也無蛋白，提示斑馬魚腎小球濾過功能正常，藥物對斑馬魚腎臟無明顯毒性。說明斑馬魚可作為藥物腎毒性的篩選工具。

3.3 藥物對斑馬魚腎臟毒性的作用機制

Gorgulho等[50]采用10%慶大霉素、撲熱息痛和替諾福韋對斑馬魚幼魚腎臟的影響進行觀察，結果顯示慶大霉素和撲熱息痛降低腎清除率，撲熱息痛和替諾福韋擴大近端小管，其腎毒性機制與線粒體改變有關，包括變形、線粒體腫脹、嵴斷裂和（或）基質顆粒丟失。王雪等[51]采用Tg（∶）轉基因斑馬魚研究馬兜鈴酸的腎毒性，發現馬兜鈴酸40～80 μmol/L處理后斑馬魚的腎出現腎小球囊性膨脹、結構疏松、前腎管上皮細胞細胞排列松散、紊亂及管腔擴張樣改變，qPCR檢測發現20 μmol/L馬兜鈴酸處理24 h后nephrin蛋白（nephrin表達于腎小球足細胞，其與裂孔隔膜的形成相關）表達顯著降低，表明馬兜鈴酸誘發腎損傷的原因可能是腎小球足細胞的功能變化。以上結果說明斑馬魚是研究藥物對于腎毒性作用的良好模型，并可以利用斑馬魚模型進一步研究藥物腎毒性的相關研究。

4 評估藥物的神經毒性

4.1 斑馬魚評估神經毒性的優勢

隨著人口老齡化，神經退行性疾病的發生率也逐漸增加。近些年，研究人員發現斑馬魚作為模式生物進行藥物神經毒性研究評估較其他模型生物有不可比擬的優勢。斑馬魚的中樞神經系統排列、神經形成的過程和具體的機制以及對藥物的反應與其他脊椎動物相似，且很多神經退行性疾病蛋白與人類同源[52]。盡管斑馬魚的神經系統簡單，但可以支配復雜的生理活動，還能夠對其進行運動、學習和記憶等相關評價[53]。因此，斑馬魚作為脊椎動物模型被廣泛應用于篩選神經系統疾病藥物和某些藥物神經毒性的研究評估[54-55]。模式動物斑馬魚的死亡率、孵化率、半數致死濃度（lethal concentration 50，LC50）、斑馬魚幼魚總移動距離和平均速度是評價藥物神經毒性的主要指標。

4.2 藥物對神經毒性的影響

二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）被稱為“萬能溶劑”，在斑馬魚實驗中廣泛被用來助溶某些實驗試劑[56]，但目前關于DMSO在斑馬魚體內的神經毒性報道較少。甘津凡等[57]用0.5%、0.8%、2.5% DMSO對Tg（∶）斑馬魚胚胎及多巴胺能神經元發育的影響進行了研究，其結果發現DMSO會引起斑馬魚神經毒性，造成間腦多巴胺能神經元丟失及細胞增殖減少，導致胚胎發育障礙。尚楠等[58]將6 hpf的斑馬魚胚胎暴露于不同濃度氯丙嗪和丙戊酸鈉中，結果顯示氯丙嗪質量濃度＞4.0 mg/L、丙戊酸鈉質量濃度＞2.0 mg/L可引起斑馬魚胚胎出現濃度相關性死亡；氯丙嗪和丙戊酸鈉質量濃度達到2.0 mg/L時可顯著降低斑馬魚幼魚總移動距離和平均速度，且丙戊酸鈉毒性大于氯丙嗪。曹建斌等[59]觀察丙泊酚5、10、20 μg/mL對斑馬魚胚胎運動神經元發育的影響，結果顯示丙泊酚5 μg/mL組胚胎整體形態發育正常，但運動神經元發育受到抑制，丙泊酚10、20 μg/mL組胚胎發育停滯在原腸胚時期。提示丙泊酚暴露可抑制斑馬魚運動神經元的發育。劉靜等[60]研究牛黃鎮驚丸對斑馬魚胚胎發育的影響，結果顯示質量濃度低于200 μg/mL時，未見胚胎發育異常。質量濃度高于200 μg/mL時，胚胎頭眼發育較小，瞳孔無色；心臟畸形、心率較弱、血流受阻；尾干扭曲，卵黃囊延伸結構變粗，脊索變細等。說明牛黃鎮驚丸質量濃度大于200 μg/mL時對斑馬魚胚胎的神經系統、心血管系統和骨骼等發育均有影響。

4.3 藥物對斑馬魚神經毒性的作用機制

王翀昊等[61]以斑馬魚為動物模型研究烏頭堿0.1、0.5、1、10、100 μmol/mL的神經毒性并初步探索其神經毒性的致病機制，結果發現烏頭堿濃度大于0.5 μmol/mL時可呈劑量相關性的顯著性降低斑馬魚游泳活力、幼魚的肌節長度，抑制Rohon- Beard神經元的生理性凋亡，推測其神經毒性與抑制乙酰膽堿酯酶活性有關。但有研究認為，藥物的神經毒性機制與提高乙酰膽堿酯酶（acetyl cholinesterase，AChE）活力有關。朱璧然等[62]研究氯硝柳胺5、10、20、40、80 μg/L對斑馬魚幼魚的神經毒性，結果顯示氯硝柳胺40、80 μg/L處理幼魚存活率降低、畸形率增加、運動速度降低，且幼魚微球蛋白前體（microglobulin precursor，）和α微球蛋白mRNA表達降低、AChE活力增加。顧杰等[63]采用幼魚染毒、運動行為學測試和胚胎整條原位雜交等實驗以及熒光定量PCR手段，來研究雙酚AP（bisphenol AP，BPAP）和雙酚AF（bisphenol AF，BPAF）對斑馬魚早期神經發育和行為的影響，發現BPAP和BPAF可擾亂斑馬魚運動軌跡，降低平均運動速度和移動距離，使其出現呆滯現象，推測其神經毒性機制與抑制斑馬魚神經發育關鍵基因和突觸蛋白基因（synapsin ΙΙa，）的表達有關。王雪等[64]研究岡田酸0.05、0.10、0.20 μmol/L對斑馬魚幼魚神經行為功能的影響，結果顯示0.05、0.10 μmol/L岡田酸處理后幼魚存活率、游動軌跡無明顯差異。但0.20 μmol/L岡田酸處理后幼魚存活率、游動活力、游動距離明顯降低，呆滯時間明顯延長，且幼魚體內蛋白磷酸酶2A（protein phosphatase 2A，）表達水平明顯下調，α7煙堿型乙酰膽堿受體（α7 nicotinic acetylcholine receptor，）基因表達水平則無明顯改變。說明岡田酸的神經毒性與基因相關。

5 評估藥物的脾臟毒性

脾臟是斑馬魚重要的免疫器官，主要起調控免疫作用，在對抗外來抗原方面至關重要。鄭美娜等[65]探索香澤蘭總黃酮對斑馬魚脾臟顯微組織結構的毒性作用結果發現，隨著香澤蘭總黃酮水觸媒染毒濃度的增加，斑馬魚脾臟顯微組織結構出現了不同程度的病變，主要表現含鐵血黃素沉著增多，脾竇擴張，脾臟內淋巴細胞增多，血細胞核濃縮、溶解，甚至導致脾臟壞死。說明模式生物斑馬魚是可以用來作為藥物脾臟毒性研究評估的實驗模型。

6 評估藥物的急性毒性

6.1 斑馬魚評估藥物急性毒性的優勢

安全性和有效性是藥物的兩大基本屬性，而我國傳統中藥，成分復雜、配伍多樣，為避免臨床使用中的不良反應，對藥物進行臨床前毒性評價和安全性評估顯得尤為重要。急性毒性實驗是評價藥物安全性的主要指標，對闡明藥物的毒性作用和探索其毒性靶器官具有重大意義[66]。與其他模型動物相比，斑馬魚具有發育快、易獲取、易觀察、易檢測等顯著的優勢，其胚胎也被廣泛應用于藥物早期急性毒性研究評估。在斑馬魚急性毒性試驗中，常選用LC50來表示該藥物的急性毒性大小。

6.2 藥物對急性毒性的影響

陳宏降等[67]研究魚腥草地上部分、魚腥草根莖、三白草地上部分、三白草根莖的95%乙醇提取物對斑馬魚成魚和胚胎的急性毒性，發現4種藥物的LD50分別為2.85、10.40、2.54、1.19 mg/L，且致畸主要表現為心包和卵黃囊水腫，提示這4種藥物的急性毒性主要體現在心臟。熊關慶等[68]研究了和厚樸酚0.1、0.2、0.4、0.6、0.8 mg/L對斑馬魚的毒性損傷，發現和厚樸酚處理96、72、48、24 h后LC50分別為（0.530±0.014）、（0.679±0.013）、（0.758±0.012）、（0.816±0.01）mg/L，其安全濃度為（0.264±0.003）mg/L。和厚樸酚處理斑馬魚后雖未出現明顯的臨床病理變化，但組織病理學顯示斑馬魚的鰓和腦出現充血，還可見鰓呼吸上皮壞死，提示鰓和腦可能是和厚樸酚對斑馬魚的主要毒性靶器官。林青華等[69]通過比較檳榔不同炮制品對斑馬魚的LC50值及其生物堿、鞣質類成分的含量，探討檳榔的毒性成分，發現生檳榔、炒檳榔和焦檳榔對斑馬魚幼魚的LC50值分別為29.74、32.47、40.03 μg/mL，水提物中總生物堿的含量依次為生檳榔＞炒檳榔＞焦檳榔，總鞣質含量依次為炒檳榔＞生檳榔＞焦檳榔，提示炒檳榔、焦檳榔的急性毒性較生檳榔低，且生物堿類成分可能是其毒性成分。費倩倩等[70]采用代謝組學的手段研究三七總皂苷給藥1 d后對Tuebingen品系斑馬魚胚胎急性毒性作用及可能機制，結果表明，隨著三七總皂苷給藥時間的延長，斑馬魚幼魚內源性代謝物的改變越加明顯，且呈現出時間相關性代謝軌跡，提示三七總皂苷給藥劑量越大，斑馬魚幼魚出現毒性癥狀的時間會大大縮短，且給藥時間越長，體內代謝更紊亂。揭示了三七總皂苷過量所出現的急性毒性可能與脂質代謝、氨基酸代謝以及能量代謝等代謝通路的紊亂有關。此外，1-萘酚、醋酸甲羥孕酮、姜黃素等對斑馬魚急性毒性研究也取得了一定的成果[70-76]。斑馬魚在藥物急性毒性中的研究見表3。

表3 斑馬魚在藥物急性毒性中的研究

TD50-半數中毒劑量 EC50-半數致畸濃度 IC50-半數抑制濃度 impdh1b-IMP(次黃苷單磷酸)脫氫酶1b impdh2-IMP(次黃苷單磷酸)脫氫酶2 IMPDH-IMP(次黃苷單磷酸)脫氫酶 TI-致畸指數

TD50-median toxic dose EC50-medianteratogenic concentration IC50-median inhibiting concentration impdh1b-IMP (inosine monophosphate) dehydrogenase 1b impdh2-IMP (inosine monophosphate) dehydrogenase 2 IMPDH-IMP (inosine monophosphate) dehydrogenase TI-Teratogenic Index

7 結語及展望

斑馬魚作為一個整體的模型生物，具有易于養殖、給藥量少、成本廉價、毒性評價指標多樣化等特點，其胚胎和幼魚可作為高通量藥物篩選的實驗模型，既彌補了細胞模型的單一性，又彌補了嚙齒動物模型的長時間性，符合動物福利的“3R”（減少、替代和優化）理論，被廣泛應用于藥物和環境污染物的毒性研究，特別是對我國具有分類龐雜、種類繁多和成分復雜的傳統單味中藥、復方和中成藥的毒性作用評估。此外，模式生物斑馬魚在藥物活性物質篩選研究、疾病機制研究、藥物體內代謝研究和藥物作用機制研究等方面也發揮著越來越重要的作用。

總結文獻資料顯示，藥物毒性研究主要集中于斑馬魚心血管、肝臟、腎臟、神經、脾臟等方面，其主要表現為死亡率和畸形率增加、器官形態和表型改變、可能伴有水腫等發生等。部分研究從整體情況探討了藥物的器官毒性，少部分研究探索了藥物毒性機制，總結發現其主要影響細胞凋亡、炎癥以及特異性表達蛋白或酶等，影響斑馬魚胚胎或幼魚的發育從而產生一定的毒性。

目前斑馬魚在中藥毒性研究中的應用還處于探索階段。在已有的很多文獻報道中，采用斑馬魚對中藥、中藥復方或中成藥進行毒性及其機制研究時，大部分都只是針對中藥里面的全部成分或個別單體化合物進行毒性檢測。而中藥或復方中包含成百上千種的化合物，各化合物之間可能通過多種途徑、多個靶點以及多個環節對機體造成不可逆轉的毒性作用。同時，在中藥或復方的相關研究中，應考慮斑馬魚模型是否具有代表性以及所測定的指標是否具有針對性。如何更簡單、更高效的利用模式生物斑馬魚明確某些中藥或復方中的毒性作用、作用靶點以及具體的毒性機制還需要更進一步的拓展研究。通常情況下，器官毒性相關指標的評價都在整體組織處理后獲得的，除神經系統毒性研究有少量特異性指標，其他器官毒性的特異性指標有待進一步發現，故在此后的研究中可考慮采用蛋白組、轉錄組、代謝組等多組學技術研究分子信號通路探索藥物毒性作用靶點或機制。

盡管斑馬魚模型在評估藥物毒理學方面表現出獨有的優勢，但是由于與人類物種間的差異，斑馬魚模型也存在一定的局限性。（1）在解剖結構上，斑馬魚血管直徑30～50 μm，且血液量少，在檢測血壓及采血方面難以實現；斑馬魚的呼吸系統與哺乳動物大不相同，且內臟形成較哺乳動物晚，一般發生于體節發育中期；與哺乳動物由單一始基發育形成不同，斑馬魚的消化系統由不同始基形成，故目前對斑馬魚呼吸和消化系統的藥物篩選研究較為困難；（2）在基因層面上，斑馬魚基因雖與人類基因高度相似，但也存在差異，不少基因功能與人體差異明顯，為更好探究不同基因的作用，可采用斑馬魚配合其他動物模型，特別是哺乳動物（如小鼠等）模型進行進一步的驗證。同時，斑馬魚實驗動物未實現標準化，沒有統一的規格和質控方法，故藥物研究結果的穩定性和重復性值得研究者思考。

此外，目前只有少量的文獻報道過關于斑馬魚胰腺、脂質代謝和免疫系統方面的毒性作用，筆者猜測其可能的原因是這些器官和系統的代謝紊亂很難在光學顯微鏡下被觀察到[77]。然而，人類的這些器官和系統是常被懷疑為毒性物質暴露的靶點，這些靶點可能與人類某些疾病的發生有密切聯系。因此，這些亟待解決的疑難問題依舊是今后科研人員重點研究的對象。

綜上所述，在眾多的模型動物中，斑馬魚作為一種評估藥物安全性與毒性最為高效、快速、便捷的方法，可以闡明藥物具體的毒性作用及其多組分多靶點的毒性作用機制，目前已受到了醫藥學界和科研學界的廣泛關注。隨著人類社會科學技術的不斷發展和創新，這一新興的模式生物在藥物毒性研究領域將會有更加廣闊的應用前景，同時也為推動中藥的研究與開發提供新的思路和新的平臺。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

[1] Howe K, Clark M D, Torroja C F,. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome [J]., 2013, 496(7446): 498-503.

[2] Gratacap R L, Wheeler R T. Utilization of zebrafish for intravital study of eukaryotic pathogen-host interactions [J]., 2014, 46(1): 108-115.

[3] Lin C Y, Chiang, Tsai H J. Zebrafish and Medaka: New model organisms for modern biomedical research [J]., 2016, 23: 19.

[4] Laale H W. The biology and use of zebrafish, Brachydanio rerio in fisheries research. A literature review [J]., 1977, 10(2): 121-173.

[5] Hermsen S A B, van den Brandhof E J, van der Ven L T M,. Relative embryotoxicity of two classes of chemicals in a modified zebrafish embryotoxicity test and comparison with theirpotencies [J]., 2011, 25(3): 745-753.

[6] He J H, Gao J M, Huang C J,. Zebrafish models for assessing developmental and reproductive toxicity [J]., 2014, 42: 35-42.

[7] Péry A R, Devillers J, Brochot C,. A physiologically based toxicokinetic model for the zebrafish[J]., 2014, 48(1): 781-790.

[8] Streisinger G, Walker C, Dower N,. Production of clones of homozygous diploid zebra fish () [J]., 1981, 291(5813): 293-296.

[9] Steele S L, Prykhozhij S V, Berman J N. Zebrafish as a model system for mitochondrial biology and diseases [J]., 2014, 163(2): 79-98.

[10] 王成, 龔莉虹, 郭朝成, 等. 模式生物斑馬魚在中藥藥效物質篩選中的應用進展 [J]. 中草藥, 2019, 50(24): 6125-6134.

[11] de Abreu M S, Giacomini A C V V, Genario R,. Neuropharmacology, pharmacogenetics and pharmacogenomics of aggression: The zebrafish model [J]., 2019, 141: 602-608.

[12] Sieber S, Grossen P, Bussmann J,. Zebrafish as a preclinicalscreening model for nanomedicines [J]., 2019, 151/152: 152-168.

[13] Guth B D. Preclinical cardiovascular risk assessment in modern drug development [J]., 2007, 97(1): 4-20.

[14] Rocke J, Lees J, Packham I,. The zebrafish as a novel tool for cardiovascular drug discovery [J]., 2009, 4(1): 1-5.

[15] Tu S, Chi N C. Zebrafish models in cardiac development and congenital heart birth defects [J]., 2012, 84(1): 4-16.

[16] Felker A, Prummel K D, Merks A M,. Continuous addition of progenitors forms the cardiac ventricle in zebrafish [J]., 2018, 9: 2001.

[17] Kitambi S S, Nilsson E S, Sekyrova P,. Small molecule screening platform for assessment of cardiovascular toxicity on adult zebrafish heart [J]., 2012, 12: 3.

[18] Milan D J, MacRae C A. Zebrafish genetic models for arrhythmia [J]., 2008, 98(2/3): 301-308.

[19] 何俊霖, 于思, 曹治興, 等. 異甘草素對斑馬魚胚胎發育、血管生成和心臟的影響 [J]. 四川動物, 2018, 37(6): 672-677.

[20] 趙慧, 費飛, 叢麗燁, 等. 阿霉素誘導的斑馬魚心肌損傷模型研究 [J]. 上海中醫藥大學學報, 2019, 33(1): 50-55.

[21] 曹雨誕, 張楷承, 姚芳, 等. 京大戟醋制前后對斑馬魚胚胎心臟的毒性 [J]. 中國實驗方劑學雜志, 2019, 25(24): 73-77.

[22] 石亞楠, 姚磊, 王佑華, 等. 氯化鋇對斑馬魚心臟毒性的初步研究 [J]. 中國藥理學通報, 2019, 35(1): 145- 146.

[23] 胡銀, 劉恒, 嚴湘蕓, 等. 多肽301LARSLKT307對斑馬魚胚胎早期心臟發育的影響 [J]. 安徽醫科大學學報, 2019, 54(5): 678-684.

[24] 王冬梅, 谷從友, 劉銅, 等. 諾氟沙星對斑馬魚胚胎發育的毒性作用及對TGF-β1的影響 [J]. 生物技術通報, 2016(1): 169-173.

[25] 楊雨婷, 何育霖, 張雪, 等. 廣藿香油及其主要成分對斑馬魚胚胎發育毒性的比較研究 [J]. 中國民族民間醫藥, 2015, 24(21): 14-16.

[26] 何育霖, 楊雨婷, 何貝軒, 等. 紫草素對斑馬魚胚胎毒性和血管抑制作用 [J]. 中成藥, 2016, 38(2): 241-245.

[27] 何貝軒, 楊雨婷, 何育霖, 等. 木香揮發油對斑馬魚胚胎發育毒性的初步研究 [J]. 中華中醫藥雜志, 2016, 31(11): 4714-4716.

[28] Wallace K N, Yusuff S, Sonntag J M,. Zebrafish hhex regulates liver development and digestive organ chirality [J]., 2001, 30(3): 141-143.

[29] Field H A, Ober E A, Roeser T,. Formation of the digestive system in zebrafish. I. liver morphogenesis [J]., 2003, 253(2): 279-290.

[30] Korzh S, Pan X F, Garcia-Lecea M,. Requirement of vasculogenesis and blood circulation in late stages of liver growth in zebrafish [J]., 2008, 8(1): 84.

[31] Menke A L, Spitsbergen J M, Wolterbeek A P,. Normal anatomy and histology of the adult zebrafish [J]., 2011, 39(5): 759-775.

[32] Tao T, Peng J. Liver development in zebrafish (Danio rerio) [J]., 2009, 36(6): 325-334.

[33] 馮勝虎, 韓銘, 成軍. 模式生物斑馬魚在肝臟疾病研究中的應用 [J]. 診斷學理論與實踐, 2015, 14(4): 389- 392.

[34] 段亞輝, 張云, 王雪, 等. 基于模式生物斑馬魚的款冬葉肝腎毒性比較研究 [J]. 中草藥, 2019, 50(3): 669- 674.

[35] 全云云, 周憶夢, 劉美辰, 等. 斑馬魚模型評價何首烏中18種成分的肝臟毒性 [J]. 天然產物研究與開發, 2018, 30(5): 744-752.

[36] 全云云, 周憶夢, 劉美辰, 等. 斑馬魚模型篩選何首烏肝毒性的物質基礎 [J]. 中國實驗方劑學雜志, 2019, 25(6): 52-57.

[37] 付曉春, 沈小莉, 俞航萍, 等. 雷公藤多苷促進斑馬魚肝細胞凋亡的實驗研究 [J]. 中國醫院藥學雜志, 2019, 39(10): 1032-1038.

[38] 代一航, 趙崇軍, 田敬歡, 等. 香加皮水提取物對斑馬魚幼魚肝臟毒性的初步研究 [J]. 環球中醫藥, 2017, 10(10): 1161-1166.

[39] 李娟娟, 韓利文, 邱昌輝, 等. 吡嗪酰胺對斑馬魚胚胎發育和氧化應激效應的影響 [J]. 中國抗生素雜志, 2018, 43(11): 1419-1425.

[40] 李二文, 趙崇軍, 馮丹, 等. 芫花水提取物對斑馬魚肝臟的毒性作用 [J]. 中華中醫藥雜志, 2019, 34(4): 1747- 1750.

[41] Quan Y Y, Gong L H, He J L,.induces hepatotoxicity by activating NF-κB inflammatory pathway and P53 apoptosis pathway in zebrafish [J]., 2019, 306: 66-79.

[42] 陳朝紅, 劉志紅. 模式動物斑馬魚在腎臟疾病研究中的應用 [J]. 腎臟病與透析腎移植雜志, 2016, 25(2): 159-164.

[43] Chambers B E, Wingert R A. Mechanisms of nephrogenesis revealed by zebrafish chemical screen: Prostaglandin signaling modulates nephron progenitor fate [J]., 2019, 143(1): 68-76.

[44] Hill A J, Bello S M, Prasch A L,. Water permeability and TCDD-induced edema in zebrafish early-life stages [J]., 2004, 78(1): 78-87.

[45] Naylor R W, Qubisi S S, Davidson A J. Zebrafish pronephros development [J]., 2017, 60: 27-53.

[46] Drummond I A, Davidson A J. Zebrafish kidney development [J]., 2010, 100: 233-260.

[47] Hentschel D M, Park K M, Cilenti L,. Acute renal failure in zebrafish: A novel system to study a complex disease [J]., 2005, 288(5): F923-F929.

[48] 梁錦鋒, 朱勇, 張洪瑤, 等. 斑馬魚模型在藥物研發早期腎臟毒性中的應用研究 [J]. 中國比較醫學雜志, 2016, 26(9): 30-35.

[49] 陳雪園, 張如松, 楊蘇蓓. 款冬花化學成分及藥理毒理研究進展 [J]. 亞太傳統醫藥, 2012, 8(1): 173-174.

[50] Gorgulho R, Jacinto R, Lopes S S,. Usefulness of zebrafish larvae to evaluate drug-induced functional and morphological renal tubular alterations [J]., 2018, 92(1): 411-423.

[51] 王雪, 劉可春, 王榮春, 等. 馬兜鈴酸對斑馬魚胚胎腎毒性作用 [J]. 動物學雜志, 2015, 50(5): 773-779.

[52] Laird A S, Mackovski N, Rinkwitz S,. Tissue- specific models of spinal muscular atrophy confirm a critical role of SMN in motor neurons from embryonic to adult stages [J]., 2016, 25(9): 1728-1738.

[53] Cornet C, di Donato V, Terriente J. Combining zebrafish and CRISPR/Cas9: Toward a more efficient drug discovery pipeline [J]., 2018, 9: 703.

[54] Khan K M, Collier A D, Meshalkina D A,. Zebrafish models in neuropsychopharmacology and CNS drug discovery [J]., 2017, 174(13): 1925- 1944.

[55] 陳香平, 黃長江, 陳元紅, 等. 鉛和得克隆聯合暴露對斑馬魚胚胎的神經毒性作用 [J]. 生態毒理學報, 2017, 12(3): 309-316.

[56] Kais B, Schneider K E, Keiter S,. DMSO modifies the permeability of the zebrafish () chorion- implications for the fish embryo test (FET) [J]., 2013, 140/141: 229-238.

[57] 甘津凡, 吳永梅, 李淑蓉, 等. 不同濃度的二甲基亞砜對斑馬魚胚胎及其多巴胺能神經元發育的影響 [J]. 第三軍醫大學學報, 2019, 41(16): 1538-1544.

[58] 尚楠, 張勤麗, 候美娟, 等. 藥物神經發育毒性比較及篩查模型建立 [J]. 中國醫院藥學雜志, 2020, 40(7): 775-780.

[59] 曹建斌, 朱敏淑, 曹東航, 等. 丙泊酚對斑馬魚胚胎運動神經元發育的影響 [J]. 浙江醫學, 2019, 41(10): 1010-1012.

[60] 劉靜, 張靖溥, 孟杰, 等. 牛黃鎮驚丸對斑馬魚胚胎發育的影響 [J]. 藥物評價研究, 2017, 40(7): 931-934.

[61] 王翀昊, 王心童, 朱娜. 烏頭堿在斑馬魚胚胎和幼魚發育過程中的神經毒性作用 [J]. 中國實驗診斷學, 2018, 22(8): 1432-1435.

[62] 朱璧然, 李博, 馮秋珍, 等. 氯硝柳胺對斑馬魚幼魚的神經毒性研究 [J]. 中國寄生蟲學與寄生蟲病雜志, 2019, 37(5): 588-592.

[63] 顧杰, 王宏燁, 廖振東, 等. 雙酚AP和雙酚AF對斑馬魚的早期神經發育毒性作用研究 [J]. 環境與職業醫學, 2019, 36(1): 11-16.

[64] 王雪, 劉可春, 楊學亮, 等. 岡田酸對斑馬魚幼魚神經行為功能的影響 [J]. 實驗動物與比較醫學, 2020(3): 190-195.

[65] 鄭美娜, 劉金榮, 吳雄宇, 等. 香澤蘭總黃酮對斑馬魚脾臟毒性病理組織學作用 [J]. 中獸醫醫藥雜志, 2012, 31(1): 5-8.

[66] 趙崇軍, 田敬歡, 王金鳳, 等. 斑馬魚在中藥研究中的應用進展 [J]. 中草藥, 2015, 46(17): 2635-2648.

[67] 陳宏降, 劉佳楠, 阮洪生, 等. 魚腥草、三白草地上部分和根莖醇提物對斑馬魚成魚和胚胎的毒性研究 [J]. 中成藥, 2020, 42(6): 1633-1636.

[68] 熊關慶, 馮楊, 楊玉涔, 等. 厚樸酚對斑馬魚()的急性毒性病理損傷評估 [J]. 四川農業大學學報, 2020, 38(1): 105-112.

[69] 林青華, 屈文佳, 秦華珍, 等. 檳榔不同炮制品對斑馬魚急性毒性比較研究 [J]. 亞太傳統醫藥, 2020, 16(2): 9-11.

[70] 費倩倩, 韋英杰, 汪晶, 等. 基于代謝組學研究三七總皂苷在斑馬魚幼魚中的急性毒性機制 [J]. 中國中藥雜志, 2019, 44(17): 3798-3805.

[71] 任平平, 舒莉萍, 王一慧, 等. 1-萘酚胚胎期暴露對斑馬魚發育的毒性作用 [J]. 第三軍醫大學學報, 2019, 41(14): 1321-1327.

[72] 泰剛, 張蕻, 趙思俊, 等. 醋酸甲羥孕酮對斑馬魚急性毒性和生殖毒性作用研究 [J]. 中國藥物與臨床, 2017, 17(10): 1451-1453.

[73] 劉靜, 張靖溥, 孟杰, 等. 骨刺片對斑馬魚胚胎發育的急性毒性研究 [J]. 藥物評價研究, 2018, 41(10): 1804-1809.

[74] 楊迷芳, 馬蘭, 嚴冬琳, 等. 麥考酚酸對斑馬魚胚胎顱面部發育的影響 [J]. 口腔醫學, 2019, 39(2): 103-107.

[75] 王英紅, 徐虹, 孔慶鑫, 等. 雙酚S急性暴露對斑馬魚胚胎及子代胚胎發育的毒性效應 [J]. 中國衛生檢驗雜志, 2019, 29(1): 32-36.

[76] 陳嬌嬌, 王濤, 王成蹊, 等. 姜黃素對斑馬魚胚胎及幼魚急性毒性的研究 [J]. 深圳中西醫結合雜志, 2017, 27(19): 1-4.

[77] 李盛, 龍鼎新. 斑馬魚在發育毒理學研究中的應用 [J]. 實用預防醫學, 2016, 23(6): 762-765.

Research progress on application and mechanism of zebrafish in drug toxicology assessment

LI Hong-yan, XIE Qian, WANG Cheng, LI Jin-xiu, MA Rong, REN Mi-hong, LI Yong, WANG Jia-jun, CHEN Hai, WANG Jian

School of Pharmacy, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, Chengdu 611137, China

Compared with other mammals, zebrafish have the characteristics of strong reproduction ability, large reproduction capacity, short life cycle, low breeding cost, and transparent body. The cardiovascular, liver, kidney, nerve, spleen and acute toxicity of zebrafish were reviewed in this paper. The results showed that multiple organs of zebrafish were highly similar to mammals in terms of morphology, gene expression and physiological characteristics, and they have been widely used in drug screening studies. Studies on drug toxicity to zebrafish mainly focus on: increased mortality and malformation rate, changes in the morphology and phenotype of the heart, liver, kidney, spleen and other organs, as well as whether it is accompanied by edema, neurotoxicity, etc.; The toxicity mechanism mainly involves affecting cell apoptosis in organs (p53 pathway), inflammation (NF-κB and interleukin), or proteins, enzymes or mRNA that affect the function of the organ, such as ALT, AST, AChE,, and α tubulin. It shows that the zebrafish model can be used as the most efficient, fast and convenient method for evaluating the safety and toxicity of drugs, elucidating the toxic effects of drugs and their multi-component and multi-target toxic mechanisms, which can provide new ideas for drug toxicology.

zebrafish; drug toxicology; toxicity assessment; safety evaluation; cardiovascular, liver toxicity; kidney toxicity; nerve toxicity; spleen toxicity; acute toxicity

R285.53

A

0253 - 2670(2021)01 - 0278 - 11

10.7501/j.issn.0253-2670.2021.01.033

2020-09-16

國家自然科學基金面上項目（81873023）；國家自然科學基金面上項目（81473371）

李紅燕（1995—），女，四川閬中人，碩士，研究方向為中藥不良反應與合理用藥。E-mail: 2390346837@qq.com

王 建（1959—），女，博士生導師，教授，研究方向為中藥不良反應與合理用藥。E-mail: jianwang08@163.com

[責任編輯 崔艷麗]