星點設計-效應面法優選七珠膠囊預防CCl4致小鼠急性肝損傷最佳劑量配伍的研究*

陶 山，李 倩，范 妤，△，翟秉濤，史曉燕，段麗芳

（1．陜西中醫藥大學基礎醫學院，陜西 咸陽 712046；2．陜西省中藥基礎與新藥研究重點實驗室，陜西 咸陽 712046）

七珠膠囊由太白楤木、湖北海棠、葉下珠3味中藥組成，針對“濕熱毒邪內侵，肝失疏泄，氣滯血瘀”的中醫理論[1]，以解毒祛濕、疏肝化瘀為治法進行組方遣藥，主要用于治療急慢性肝炎、肝損傷、肝纖維化。太白楤木具有驅風濕、散瘀血、止痛的功效。近年研究發現，太白楤木具有抗氧化、抗炎等作用，臨床多用于治療各種肝炎、肝硬化以及淋巴結腫大等癥[2-4]。湖北海棠具有養肝和胃、消積化滯等功效，以往研究表明，湖北海棠對急慢性肝損傷有顯著的保護作用[5-8]。葉下珠具有平肝清熱、利水解毒的功效，在治療傳染性肝炎、痢疾等病中有很好的療效[9-10]。本實驗以太白楤木、湖北海棠、葉下珠3味藥的有效部位提取物—太白楤木總皂苷、湖北海棠總黃酮、葉下珠總多酚作為七珠膠囊原料進行配伍，通過腹腔注射CCl4橄欖油溶液復制急性肝損傷小鼠模型，應用星點設計-效應面法優選確定七珠膠囊在預防急性肝損傷中各組分配伍的最佳劑量，為其臨床應用提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 6周齡昆明種小鼠136只，雌雄各半，體質量（20±2）g，清潔級，由西安交通大學動物實驗中心提供，動物生產許可證號：SCXK（陜）2012-003。適應性飼養于（25±2）℃恒溫動物房中，正常明暗交替，自如飲食飲水。

1.2 藥物與試劑 太白楤木藥材購于陜西眉縣藥材公司，經陜西中醫藥大學王繼濤高級實驗師鑒定為五加科（Araliaceae）植物太白楤木（Aralia taibaiensis）的根皮；湖北海棠藥材購自湖北神農架藥材公司，經陜西中醫藥大學王繼濤老師鑒定為蘋果屬（Malus Mil）湖北海棠（Malus hupehensis（Pamp.）Rehd）的干燥葉；葉下珠藥材購自陜西昊源中藥飲片有限公司，陜西中醫藥大學王繼濤老師鑒定為大戟科植物葉下珠（Phyllanthus urinaria L.）的帶根全草；CCl4（天津天士力化學試劑有限公司，批號：20140228）；橄欖油（廣州花之王化工有限公司，批號：20140528）；丙氨酸氨基轉移酶（ALT）、天門冬氨酸氨基轉移酶（AST）試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號分別為：20140909、20140923）；其它試劑均為分析純。

1.3 儀器 Centrifuge 5417R臺式冷凍高速離心機（Germany Eppendorf），HHS-4A 電熱恒溫水浴鍋（滬越實驗儀器廠），JA2003型電子分析天平（上海梅特勒-托利多儀器有限公司，精度：1 mg），BIORAD Model 680酶標儀（北京伯樂生命科學發展有限公司）。

1.4 實驗方法

1.4.1 實驗分組 潔凈級136只昆明種小鼠，隨機分為17組，每組8只。以七珠膠囊各組分作為星點設計實驗方案的考察因子，以太白楤木總皂苷、湖北海棠總黃酮、葉下珠總多酚作為因素，各因素分別在前期實驗篩選結果確定的有效劑量范圍內均勻選取3個水平[11-12]，分組情況見表2。

1.4.2 造模方法 昆明種小鼠雌雄分籠飼養，適應性飼養5 d后用于實驗。各給藥組均按表1所設計劑量進行灌胃給藥7 d，1次/d。末次給藥后2 h，將0.1%的CCl4橄欖油溶液按0.1 mL/10 g進行腹腔注射，建立小鼠急性肝損傷模型[13]。在給藥及建立急性肝損傷模型過程中，各組小鼠飲食、活動佳，均未見不良反應，無死亡。

1.4.3 取材 末次給藥后禁食不禁水，16 h后摘眼球取血，3 000×g離心10 min分離血清，放入-20℃冰箱保存備用。

1.4.4 血清生化指標ALT、AST的測定 微板法檢測小鼠血清AST、ALT含量，嚴格按照試劑盒說明書步驟進行，酶標儀570 nm處測定OD值，實驗重復3次。

2 結果

2.1 星點設計法優選最佳配伍比例 根據星點設計原理[14-15]，在單因素基礎上，選取太白楤木總皂苷（X1）、湖北海棠總黃酮（X2）、葉下珠總多酚（X3）為考察因素，每個因素設3個水平，用代碼值-1、0、1來表示 。因素水平見表1，實驗安排和結果見表2。

表1 星點設計因素與水平

表2 星點試驗設計與結果表

2.2 模型擬合 用ANOVA分析效應面的回歸參數。利用Design-Expert 8.0.6軟件對表2數據進行多元回歸擬合，得到七珠膠囊不同配伍組血清中AST、ALT指標對太白楤木/A、湖北海棠/B、葉下珠/C二項多次回歸模型方程：綜合評分Y=0.33-0.059A-0.069B+0.074C+0.17AB-0.10AC+0.057BC-0.13A2+0.091B2-8.877E-003C2，式中評分代表肝損傷小鼠血清含AST、ALT酶的活力，A、B、C分別代表太白楤木總皂苷，湖北海棠總黃酮，葉下珠總多酚3種組分的含量。該方程的相關系數R2=0.835 0，整體模型達到顯著水平（P=0.042 3），能夠反映血清酶活力與3味提取物給藥量的關系。由表3可知，本實驗設定區域范圍內，整體模型達到顯著水平（P=0.042 3），表明太白楤木總皂苷、湖北海棠總黃酮對酶的活力有明顯影響，二次項中A、B的偏回歸系數達顯著水平，其他各項的偏回歸系數均未達到顯著水平。但是，回歸方程失擬檢驗顯著（P=0.000 5），說明未知因素對實驗結果有一定干擾，后續需要進一步研究；模型擬合檢驗極顯著，說明該方程與實際情況擬合很好，較好地反映了血清酶活力與3味提取物給藥量的關系，因此得到的回歸方程能較好的預測七珠膠囊不同配伍對急性肝損傷小鼠血清ALT、AST隨各參數的變化規律。

表3 以AST和ALT為指標的擬合回歸方程的方差分析結果

2.3 配伍優化與預測 在因變量與另兩因素擬合為三維曲面圖中，因只能表達含2個因素變量的函數，故固定3個變量中的1個為中值，以擬合的目標函數為數學模型，繪制因變量曲面圖（圖1、2、3），最終確定七珠膠囊最佳劑量配比為：太白楤木總皂苷0.05 g/kg，湖北海棠總黃酮0.84 g/kg，葉下珠總多酚1.25 g/kg。

圖1 太白楤木總皂苷與湖北海棠總黃酮對AST、ALT的影響

圖2 太白楤木總皂苷與葉下珠總多酚對AST、ALT的影響

圖3 湖北海棠總黃酮與葉下珠總多酚對AST、ALT的影響

3 討論

肝毒劑CCl4所誘導的肝損傷是最經典的化學性動物肝損傷造模方法，因模型簡單易于執行、造模時間短等特點被廣泛用于研究化學性肝損傷、肝纖維化發生的細胞分子機制以及保肝藥物的篩選[16-17]。ALT、AST均為肝細胞內酶，其中，ALT是最常用的判斷肝細胞是否受損的敏感性指標，AST水平高低則代表著肝細胞損傷的程度。正常情況下，血清中ALT、AST的含量較少，當肝損傷發生時，大量的ALT、AST從肝細胞進入血液，使血液中含量顯著升高[18]。目前，血清ALT、AST是檢測肝損傷的特異性標志，也是判斷肝細胞損傷程度最為敏感的指標[19]。

七珠膠囊原制劑為湯劑，是由太白楤木、湖北海棠、葉下珠3味藥組成，可有效治療急慢性肝炎、肝纖維化，但攜帶不便，課題組前期研究中將其改為膠囊劑[20]。太白楤木總皂苷為太白楤木的主要活性成分，來源于其根皮。研究發現太白楤木總皂苷對于腦、心臟、肝臟都有保護作用[2，4]。湖北海棠總黃酮是從湖北海棠葉中提取的黃酮類成分，對于急慢性肝損傷治療作用顯著。研究發現湖北海棠葉總黃酮可減輕CCl4及酒精所致的大鼠肝臟損傷程度，以及抑制血吸蟲所致的肝纖維化[6-7]。葉下珠總多酚具有較高的抗氧化活性，可降低肝細胞氧化應激損傷，有效保護肝功能，在治療免疫性肝損傷中作用顯著[9]。本實驗結果顯示，各給藥組小鼠在以不同劑量組合灌胃后，血清中ALT、AST與模型組比較均有不同程度降低，表明七珠膠囊各成分配伍給藥均能有效抑制肝損傷，修復受損肝組織。

星點設計-效應面法以實驗所考察的自變量對效應的作用為依據，選取最佳指數并對其進行優化[21]。即通過建立數學模型描繪三維效應面，讀取效應面較優區域的較佳配伍條件范圍，繼而回推出自變量取值范圍即最佳實驗條件的優化方法[22]。本實驗通過效應面法，以急性肝損傷小鼠血清中ALT、AST的活性水平作為指標，對七珠膠囊各組分配伍進行優化配比，得到最佳劑量配伍為：太白楤木總皂苷0.05 g/kg，湖北海棠總黃酮0.84 g/kg，葉下珠總多酚1.25 g/kg。

星點設計-效應面法精密度高、預測性好，能較為全面、精確地反映七珠膠囊在預防小鼠急性肝損傷中最佳的藥物成分配比，可為七珠膠囊的后續實驗以及臨床應用提供有效的科學依據。