蒼艾揮發(fā)油經(jīng)豚鼠外耳道給藥的安全性評(píng)價(jià)*

楊 洪，張建英，任丹妮，王進(jìn)進(jìn)，熊 磊，秦 瓊

（1.云南中醫(yī)藥大學(xué)，云南 昆明 650500；2.云南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，云南 昆明 650021）

蒼艾揮發(fā)油是以熊磊教授預(yù)防上呼吸道感染的臨床驗(yàn)方為基礎(chǔ)，選用蒼術(shù)、艾葉、丁香、藿香、豆蔻、花椒、佩蘭7味中藥組成[1]。組方氣味清香，祛風(fēng)燥濕止癢，符合“芳香化濁避穢”的用藥原則，部分藥物還有增強(qiáng)機(jī)體特異性、非特異性免疫的功能[2-3]。前期急性毒性實(shí)驗(yàn)確定了小鼠灌胃濃度為3.47 mL/kg，相當(dāng)于兒童最大用量的2 478.57倍，呼吸刺激性實(shí)驗(yàn)證明蒼艾揮發(fā)油對(duì)家兔呼吸系統(tǒng)無明顯刺激作用[4]。在對(duì)肺氣虛大鼠進(jìn)行灌胃給藥時(shí)，發(fā)現(xiàn)蒼艾揮發(fā)油高、中劑量組CD4+/CD8+比值顯著升高，能夠有效調(diào)節(jié)T細(xì)胞亞群比例，從而改善肺氣虛大鼠肺組織病理變化[5]。蒼艾揮發(fā)油經(jīng)鼻吸收后，能夠快速的分布在肺組織、心臟及腦組織中，展示了經(jīng)鼻給藥后其良好的肺靶向及腦靶向趨勢(shì)[6-7]。

前期研究發(fā)現(xiàn)蒼艾揮發(fā)油用于空氣消毒、滅菌效果優(yōu)于醋熏及紫外線消毒，且對(duì)白色念珠菌有較強(qiáng)的抑制作用[8]，其組方中單味藥所制的揮發(fā)油大都具有抗真菌作用[9-10]。在前期藥效實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)蒼艾揮發(fā)油對(duì)外耳道真菌病常見感染菌如曲霉菌、白色念珠菌、青霉菌均有一定的抑制效果[11]。隨著抗生素、激素的臨床大量應(yīng)用，外耳道真菌病發(fā)病率有上升趨勢(shì)。目前外耳道真菌病治療方法存在一定的局限性，臨床效果不盡如人意，且復(fù)發(fā)率較高[12-15]。蒼艾揮發(fā)油對(duì)外耳道真菌病常見菌群有一定的抑制作用，為進(jìn)一步研究其外耳道給藥的可行性，本實(shí)驗(yàn)通過豚鼠外耳道急性毒性、皮膚過敏性、外耳道皮膚刺激性進(jìn)行考察，為評(píng)價(jià)該制劑臨床外耳道用藥安全性提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 豚鼠，雌雄各半，體質(zhì)量219～292 g，由昆明楚商科技有限公司提供，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（滇）K2018-0001。所有動(dòng)物均飼養(yǎng)于云南中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，飼養(yǎng)室溫度（23±2）℃，濕度40%～70%，光照周期12 h，自由進(jìn)食飲水，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2 藥物與試劑 蒼艾揮發(fā)油取自云南中醫(yī)藥大學(xué)芳香療法實(shí)驗(yàn)室，蒼艾揮發(fā)油的提取[16]采用水蒸氣蒸餾法。按比例稱取蒼術(shù)、艾葉等藥物，加8倍量水，浸泡4 h，提取6 h而成。聚山梨酯80（一般藥用，廣州賽國(guó)生物科技有限公司產(chǎn)品，批號(hào)：EZ4567C109）；用聚山梨酯80作為溶劑，分別將100%蒼艾揮發(fā)油原液和聚山梨酯80放入研缽中進(jìn)行研磨，待溶解后加入適量的純凈水，稀釋成濃度分別為1%、5%、15%濃度的水溶液，每瓶各20 mL，并用等體積聚山梨酯80水溶液作為陰性對(duì)照。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 外耳道急性毒性實(shí)驗(yàn) 取健康豚鼠8只，隨機(jī)分為外耳道皮膚完整組及外耳道皮膚破損組，每組各4只。實(shí)驗(yàn)前完成稱重、右側(cè)外耳道及鼓膜的檢查。外耳道破損組使用消毒后的砂紙卷曲成小火柴棍狀，作“*”樣輕輕搔刮右側(cè)外耳道皮膚，以微微出血為原則并且不傷及鼓膜，造成臨床上自然的外耳道損傷，模擬人類自然挖耳導(dǎo)致的外耳道皮膚損傷狀況；另一組右側(cè)外耳道皮膚完整無破損。每組豚鼠做好染色標(biāo)識(shí)，前期藥效實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)15%為有效濃度，故本實(shí)驗(yàn)選用15%濃度，通過增加給藥次數(shù)，使其給藥劑量遠(yuǎn)超出臨床劑量，即為急性毒性實(shí)驗(yàn)。將15%蒼艾揮發(fā)油水溶液分別滴入豚鼠的右側(cè)外耳道內(nèi)，1次滴入20 μL，上午給藥2次，間隔4～5 h后再給藥2次。給藥次日清水清洗給藥部位，連續(xù)處理7 d[17-18]。每天記錄各組豚鼠的體質(zhì)量，觀察其飲食、皮膚、毛發(fā)、睡眠、分泌物、排泄物、外耳道及鼓膜是否有異常變化，并觀察其呼吸系統(tǒng)、中樞神經(jīng)系統(tǒng)和四肢活動(dòng)等是否有中毒表現(xiàn)。若出現(xiàn)中毒反應(yīng)，則記錄反應(yīng)的癥狀、嚴(yán)重程度、起始時(shí)間、持續(xù)時(shí)間、是否可逆等，如出現(xiàn)動(dòng)物死亡，及時(shí)觀察并尸檢，必要時(shí)進(jìn)行病理學(xué)檢查。

1.3.2 皮膚過敏性實(shí)驗(yàn) 選擇健康豚鼠16只，按不同濃度的受試藥液隨機(jī)分為4組，每組4只。于實(shí)驗(yàn)前做好染色標(biāo)識(shí)并用剪刀剪除背部面積約4 cm×4 cm的長(zhǎng)毛，剃須刀剃凈短毛，使皮膚外露，并完成稱重。將豚鼠去毛區(qū)域分為大小均等兩格，其中一格為皮膚破損面，用粗磨砂紙對(duì)豚鼠背部皮膚進(jìn)行輕微的摩擦，使皮膚表面微微出血即可；另一格為皮膚完整面，將1%、5%、15%蒼艾揮發(fā)油水劑分別滴入對(duì)應(yīng)的豚鼠背部皮膚，對(duì)照組選用聚山梨酯80水溶液滴入，每次滴入0.5 mL并用棉簽涂抹均勻，保證給藥面積均為2.5 cm×2.5 cm，且覆蓋皮膚完整面和皮膚破損面，涂抹后用無菌紗布覆蓋給藥區(qū)域，并用低過敏膠布固定，放置籠內(nèi)。6 h后除去膠布和紗布，連續(xù)給藥7 d，每天1次，末次給藥24 h后洗去殘留藥物[19]。觀察1、24、48、72 h局部皮膚的紅斑、水腫等情況，按《皮膚過敏反應(yīng)程度的評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)》[20]進(jìn)行評(píng)分。

1.3.3 外耳道皮膚刺激性試驗(yàn) 選擇健康豚鼠16只，按不同濃度的受試藥液隨機(jī)分為4組，每組各4只，并做好染色標(biāo)識(shí)，豚鼠右側(cè)外耳道為破損模型，同上處理造成外耳道損傷模型，左側(cè)外耳道為皮膚完整模型。豚鼠左右耳均放置相同濃度藥液棉球進(jìn)行對(duì)照。將1%、5%、15%的蒼艾揮發(fā)油水溶液浸透棉球，第4組用聚山梨酯80水溶液棉球浸濕作為陰性對(duì)照，將浸有藥液的棉球放置在豚鼠外耳道內(nèi)，覆蓋于外耳道內(nèi)壁，并以干凈的棉球填塞固定，外耳口軟膠布封閉固定，6 h后除去包扎和棉球，每天給藥1次，連續(xù)給藥7 d[21]。每天觀察貼藥區(qū)外耳道內(nèi)有無紅斑、水腫、出血、滲液、潰爛、色素沉著、皮膚粗糙或菲薄以及鼓膜顏色，有無穿孔等反應(yīng)，停藥后繼續(xù)觀察72 h，按《皮膚刺激反應(yīng)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)》[22]進(jìn)行評(píng)分。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組間比較，方差齊時(shí)采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，方差不齊時(shí)采用非參數(shù)檢驗(yàn)。以P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 蒼艾揮發(fā)油水溶液對(duì)豚鼠外耳道急性毒性作用涂抹藥液期間及給藥后7 d內(nèi)，所有豚鼠外觀、行為、鼓膜情況、四肢活動(dòng)、進(jìn)食、排泄等未見明顯異常，無死亡，體質(zhì)量增長(zhǎng)正常。急性毒性2組均未見明顯毒性，見圖1。完整組體質(zhì)量與破損組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表 1。

表1 蒼艾揮發(fā)油水溶液對(duì)外耳道給藥急性毒性豚鼠體質(zhì)量增長(zhǎng)的影響（（±s，n=4，g）

表1 蒼艾揮發(fā)油水溶液對(duì)外耳道給藥急性毒性豚鼠體質(zhì)量增長(zhǎng)的影響（（±s，n=4，g）

組別 給藥前 給藥3 d 給藥7 d完整組 274.80±11.68 285.30±5.83 291.45±8.35破損組 275.00±24.80 280.88±25.44 295.40±18.70

圖1 豚鼠急性毒性實(shí)驗(yàn)

2.2 皮膚過敏性實(shí)驗(yàn) 蒼艾揮發(fā)油水溶液及聚山梨酯80水溶液，涂抹豚鼠背部，皮膚完整組與皮膚破損組均未出現(xiàn)紅斑、紅腫等反應(yīng)，過敏反應(yīng)評(píng)分值均為0，致敏率為0%，評(píng)價(jià)為無致敏性，見表2。

表2 各組豚鼠皮膚過敏性評(píng)價(jià)及致敏發(fā)生率（n=4）

2.3 外耳道皮膚刺激實(shí)驗(yàn) 豚鼠外耳道完整組與破損組連續(xù)7 d涂抹蒼艾揮發(fā)油水溶液和聚山梨酯80水溶液，均未出現(xiàn)明顯的紅斑、水腫以及鼓膜變化反應(yīng)。完整組皮膚正常，皮膚破損組7 d后均正常愈合，干痂脫落，無明顯刺激性，見圖2。蒼艾揮發(fā)油水溶液、聚山梨酯80水溶液對(duì)外耳道及鼓膜刺激反應(yīng)評(píng)分，見表3。

表3 各組豚鼠皮膚刺激反應(yīng)評(píng)分（n=4）

圖2 豚鼠外耳道皮膚刺激性實(shí)驗(yàn)

3 討論

中藥揮發(fā)油在耳鼻喉科具有潛在應(yīng)用前景。有研究報(bào)道，辛夷揮發(fā)油納米脂質(zhì)體滴鼻劑用于確診的變應(yīng)性鼻炎兒童，綜合有效率和主要癥狀有效率，均高于對(duì)照組；噴嚏、鼻塞等主要癥狀及血液嗜酸性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)均較對(duì)照組改善；臨床效果好，療效肯定，副作用少，得到患者的認(rèn)可[23]。另有研究根據(jù)患者癥狀選用不同的天然植物揮發(fā)油治療兒童慢性咽炎，療效確切無副作用，易被患兒及家屬接受[24]。本課題通過探究中藥揮發(fā)油經(jīng)外耳道給藥的安全性，使其更好的應(yīng)用于耳部治療，增強(qiáng)其臨床治療效果，充分發(fā)揮中醫(yī)藥特色及優(yōu)勢(shì)。

經(jīng)外耳道給藥是治療耳科疾病的主要給藥方法，其給藥方式一般分為水劑、乳膏劑、噴霧劑給藥[25]。有報(bào)道表明水劑滴耳液使用方便，患者依從性較高，藥物分布相對(duì)均勻，療效肯定；而膏劑因患者外耳道彎曲或狹窄等因素導(dǎo)致藥物涂抹不到位，容易造成外耳道損傷，患者需經(jīng)常至門診給藥，依從性較差，從而影響治療效果[26]。目前外耳道真菌病主要治療方法為耳內(nèi)鏡清理之后運(yùn)用抗真菌藥物治療，但清理之后的藥物治療選擇及給藥方法未有明確指導(dǎo)[12]。抗真菌水劑在臨床中使用更方便，患者接受程度高，依從性好，藥物分布均勻可觸及深處的病變范圍，但應(yīng)用于耳部的抗真菌滴耳液暫無上市的外用水劑[27]。因此，研發(fā)一種抗真菌能力強(qiáng)的水劑滴耳液具有重要的臨床意義。

蒼艾揮發(fā)油是由蒼術(shù)、艾葉等組成的經(jīng)驗(yàn)方提取而來的復(fù)方精油[16]，幾乎不溶于水，通過加入助溶劑，可做成水劑。中藥揮發(fā)油不僅具有促透皮吸收作用[28]，且安全性好，對(duì)皮膚無刺激和毒性較低[29]，部分中藥揮發(fā)油因具有較強(qiáng)的抗菌、抗病毒活性而廣泛用于外科治療[30]。本實(shí)驗(yàn)選用聚山梨酯80作為助溶劑，其在經(jīng)口途徑、肌肉注射或靜脈注射藥物制劑中大量應(yīng)用，具有較寬的安全窗[31-32]。在實(shí)驗(yàn)過程中，發(fā)現(xiàn)蒼艾揮發(fā)油水溶劑安全無毒性能夠很快自然揮發(fā)，不會(huì)潴留在耳道內(nèi)，而引起不適。

為了進(jìn)一步推廣蒼艾揮發(fā)油水劑在臨床中的應(yīng)用，保證其用藥安全性，進(jìn)行外耳道急性毒性實(shí)驗(yàn)、皮膚過敏性實(shí)驗(yàn)、外耳道皮膚刺激性實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示，蒼艾揮發(fā)油水溶劑經(jīng)外耳道給藥無毒性，對(duì)豚鼠一般情況無明顯影響。給藥及恢復(fù)期間，所有豚鼠的行為、飲水進(jìn)食、排泄物、毛發(fā)基本正常。蒼艾制劑對(duì)豚鼠聽力無影響，對(duì)鼓膜、外耳道無刺激性、無過敏性等不良反應(yīng)，所有豚鼠均無死亡發(fā)生，體質(zhì)量增長(zhǎng)正常。以上結(jié)果表明蒼艾揮發(fā)油是一種安全性較高的外用中成藥，可應(yīng)用于臨床耳部局部給藥。