鼠實驗性牙周炎復合模型建立的研究進展

馮源，王柳楊，任念念 綜述 葛頌 審校

遵義醫科大學，貴州 遵義 563000

牙周炎是一項牙周組織發生慢性破壞的感染性疾病[1]，本質上是一種混合細菌感染，最終導致牙齒松動、脫落[2]。牙周炎是人類廣泛患有的疾病且發病率高，與全身系統性疾病息息相關[3]，其治療方案有待進一步研究。適合的牙周炎動物模型有助于研究人牙周炎的病因及病理改變，適用于研發藥物，最終運用于臨床的疾病治療及預防中。

1 常用牙周炎模型動物

靈長類動物的口腔構成與人最為相似，其中猴與人各方面都有較高的相似度，其造成的牙周炎模型也最為接近。但因猴屬于自然保護動物，價格昂貴且繁殖較慢，在大規模實驗研究中的應用受到較大的限制[4]。

犬牙周炎模型與人相似，其中比格犬在國外應用廣泛，但犬類品種間的差異較大，影響其易感性，且犬的攻擊性、飼養、病變程度和部位不均勻等特點也造成了其應用受限[5]。

兔口腔微生物菌群分布與人類較為相似，因其臼齒為單根，較少用于牙周炎模型的建立，常用于骨相關的研究[6]。

小型豬在與全身性疾病相關的模型建立中效果上佳[7]，也是理想的自發性牙周炎實驗模型，但價格較高、飼養復雜，目前應用較少。

鼠飼養成本較低，有足夠的數量進行研究和統計分析，生命周期短，適應能力及抗病能力強，可快速誘發疾病，是目前應用最廣泛的動物[8]。

2 鼠牙周炎復合模型的建立

2.1 牙周炎伴動脈粥樣硬化鼠模型 心腦血管疾病(cardiovascular disease，CVD)的病理基礎為動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)。牙周炎和動脈粥樣硬化的復合模型通常采用兩個或者兩個以上相結合的方案。(1)高脂飲食+腹腔注射維生素D3+磨牙結扎+口腔接種牙周致病菌復合模型：任秀云等[9]對SD大鼠行一次性腹腔內注射維生素D3，高脂飼料比例逐漸增大喂養，15周后免疫組化染色，成功建立動脈粥樣硬化模型；絲線纏繞結扎絲再以“8”字結扎鼠的磨牙，定期口腔涂布牙齦卟啉單胞菌(P.gingivalis)，15周后出現牙周炎臨床表現，成功建立牙周炎模型。張源明等[10]同上法注射維生素D3、高脂飼料喂養，免疫組化染色觀察動脈血管壁，成功建立AS模型；絲線結扎雙側磨牙，每3周接種1次由4種牙周炎致病菌標準菌的混懸液(P.g、A.a、F.n、P.i，1×109CFU/mL)于大鼠齦溝內，建立牙周炎模型。大鼠臨床牙周檢查以及病理檢查顯示牙周炎動物模型建立成功。(2)基因敲除小鼠+口腔接種牙周致病菌復合模型：CHUKKAPALLI等[11]采用4種牙周致病菌(P.gingivalis、T.denticola、T.forsythia和F.nucleatum，2.5×109CFU/mL)口腔灌洗ApoE-/-小鼠，第24周時處死小鼠，以牙槽骨吸收情況確定牙周炎的形成，以病理檢查確定動脈內膜明顯斑塊形成，牙周炎動脈粥樣硬化小鼠模型建模成功。目前，AS模型建立中普遍應用基因敲除小鼠，但以此建立牙周炎模型較為困難，因其牙齒小，口內結扎操作極為不便且效率較低；研發出基因敲除大鼠或其他較大型實驗動物將更有利于日后的模型建立及研究[12]。

2.2 糖尿病 糖尿病為一項廣泛存在的長期、慢性疾病，現普遍認為，糖尿病與牙周炎之間的關系是雙向的，即一種疾病的存在往往會增加另一種疾病發生的風險和嚴重性，反之亦然[13]。牙周炎和糖尿病復合模型通常采用多種相結合的方案。(1)高糖飲食+腹腔注射鏈脲佐菌素+正畸絲結扎+絲線結扎結扎復合模型：高脂飼料加10%高糖水喂養大鼠兩周，之后行腹腔注射鏈脲佐菌素(40 mg/kg)，血糖高于16.7 mmol/L，糖尿病建模成功；糖尿病牙周炎組用絲線纏繞結扎絲置于磨牙頸部，5 d后有明顯的牙周炎臨床癥狀，可見牙根暴露[14]，判斷牙周炎造模成功。(2)自發性T2DM大鼠模型+磨牙結扎+口腔接種牙周致病菌復合模型：OLETF為自發性T2DM大鼠，LETO為其對照組；通過制作4種牙周病原體的混懸液，將絲線浸泡后進行磨牙結扎，并每隔四周口內行牙周致病菌混懸液涂抹，20周后處死所有大鼠，micro-CT和病理切片確定其牙周炎形成[15]。OLETF大鼠作為優秀的T2DM動物模型，結合涂菌的絲線結扎能成功建立牙周炎模型。糖尿病常用藥物鏈脲佐菌素等誘導產生，其操作方便，成功率較高，但不一定反映的是T2DM真實本質的病理狀態,因而影響研究結果的可靠性。OLETF大鼠臨床表現和病理變化與人類T2DM極為相似。是目前國際上公認的最理想的2型糖尿病的動物模型之一。但其費用較高，購買過程較繁瑣，臨床尚需更合適的動物模型。

2.3 阿爾茨海默癥(Alzheimers disease，AD) 阿爾茨海默癥是一種慢性神經退行性疾病，腦組織中的β淀粉樣蛋白沉積、tau蛋白過度磷酸化、神經元丟失及炎癥反應為特征性病理改變。流行病學研究發現牙周炎是阿爾茨海默癥的危險因素，牙周致病菌如牙齦卟啉單胞菌、福賽坦氏菌等已在腦脊液及神經節中獲得分離，致病菌將自身毒性及產出的毒力因子直接作用于腦內[16]。牙周炎和阿爾茨海默復合模型方案如下：(1)APP轉基因小鼠+口腔接種牙周致病菌復合模型：從J20品系獲得雌性半合子轉基因小鼠(hAPP-J20)和非轉基因小鼠(WT)；于小鼠口內齦邊緣涂布含牙齦卟啉單胞菌的羧甲基纖維素，對照組僅涂布同量羧甲基纖維素。11周后micro-CT和組織病理學檢測其牙周炎模型造模成功，通過新奇物識別實驗對其認知功能進行評價，判斷其AD形成[17]。(2)誘導Aβ沉積+磨牙結扎復合模型：麻醉雄性SD大鼠，固定其于立體定位儀中，注射Aβ25-35于海馬體附近，縫合切口，絲線纏繞鋼絲結扎大鼠上頜雙側第二磨牙。飼養一段時間后，水迷宮實驗(MWM)顯示實驗組學習和記憶能力較差；光學顯微鏡觀察H＆E染色的腦組織切片，發現實驗組海馬CA3區受損神經元的數量較高，出現磨牙明顯的牙周臨床癥狀，AD及CP模型造模成功[18]。目前阿爾茨海默病病因的假說和理論較多，尚無定論，因此動物模型的方法尚多，能在不同方面印證某一假說或理論，但目前沒有一項動物模型及造模方法可完全模擬人類的老齡化過程及阿爾茨海默病發生過程中的病理變化。分析不同模型特點及其表現優勢，從不同致病機制綜合分析多項模型的實驗結果，能夠更真實地追溯阿爾茨海默病的病因。

2.4 類風濕關節炎(rheumatoid arthritis，RA) 類風濕關節炎是一種以關節內的炎癥發生以及周圍硬組織的破壞為主要臨床表現的自身免疫性疾病[19]。關節炎與牙周炎都有遺傳學背景,相似病理過程表現為病變部位的慢性炎癥并伴隨骨的吸收和破壞。牛Ⅱ型膠原誘導RA+口腔接種牙周致病菌復合模型：7周齡，體質量18~20 g DBA/1型雄性小鼠分為單純膠原誘導類風濕關節炎組(CIA)和P.g感染+膠原誘導RA組(CIA+P.g)。CIA：口腔內涂抹2%羧甲基纖維素；CIA+P.g：口腔內2 d一次接種含牙齦卟啉單胞菌(P.g)的羧甲基纖維素，1周后膠原誘導RA：尾部注射0.1 mol/L(膠原：100μg)乳劑。免疫后10 d行二次加強免疫，小鼠出現四肢關節腫脹，RA建模成功[20]。上述提到的各種復合模型的建立受時間、操作便捷性等影響，方法數目有限。但單一模型的建立方法仍有許多，文中尚未提及，是否能組合成為新的復合模型建立方法仍有待探索。

2.5 不同品系鼠的造模差異 實驗動物大鼠的常用品系為Wistar大鼠、Got-Kakizaki(GK)大鼠、Brown-Norway(BN)大鼠、Sprague-Dawley(SD)大鼠[21]，口腔常用為Wistar大鼠和SD大鼠，其造模后呈現的效果不盡相同。周穎芳等[22]分別用SD大鼠和Wistar大鼠Ⅱ型膠原誘導構建關節炎模型(CIA)，炎癥指數評分和病理改變均顯示SD大鼠關節炎癥重于Wistar大鼠，提示在建立CIA復合模型時可優先選擇SD大鼠。董亞南[23]在SD、Wistar大鼠最大攝氧量的增齡特征與運動強度的定量化研究中發現相同年齡階段Wistar大鼠運動能力表現優于SD大鼠，品系選擇對AD大鼠的行為學試驗表現、COPD大鼠肺功能檢測結果的影響應納入考慮范圍。郭學軍等[24]腹腔注射STZ分別建立SD、Wistar大鼠糖尿病模型，發現Wistar大鼠成模率和死亡率均高于SD大鼠，選用中劑量(55 mg/kg)給藥則可以有效提高SD大鼠成模率，降低其死亡率；陳楓等[25]則發現以35 mg/kg給藥可增高Wistar大鼠的成模率，其結果優于SD大鼠。呂曉君等[26]用改進的高熱量飼料建立了SD和Wistar大鼠肥胖模型，品系間未見明顯差異。C57BL/6J小鼠較ICR和KM更能形成良好肥胖模型[27]。通過高脂飲食誘導方式分別給予Balb/c、C57BL/6，后者更易產生具有差異的體質量增加；在糖代謝方面，前者出現代謝功能異常，而后者則無[28]。上述結果對建立糖尿病復合模型或動脈粥樣硬化復合模型具有一定參考意義。

3 鼠牙周炎相關模型的建立

非正常的咬合接觸關系或者咬合力過大導致的咀嚼系統各部位的病理性損害或者適應性變化被稱為咬合創傷[29]，咬合創傷可作為一項獨立疾病，也可作為牙周炎的一個重要的局部促進因素，尚無定論。其造模方法如下：(1)降低兩邊牙齒咬合+絲線結扎法復合模型：BUDTZ-J?GENSEN等[30]適量磨去雄性Wistar大鼠第二、第三磨牙的牙尖，以不引起牙髓炎、不暴露牙髓為標準來造成雙側第一磨牙咬合力過大；選取任一側下頜第一磨牙頸部棉線結扎,另一側不做處理。30 d后牙周炎合并創傷模型建立。組織學顯示根分叉病變，牙槽骨嵴頂明顯降低。(2)放置高嵌體+脂多糖注入牙齦法復合模型：YOSHINAGA等[31]于大鼠牙齦左下第一磨牙齦溝內注入脂多糖形成牙周炎模型，然后在對牙放置一高嵌體，致使左下第一磨牙形成創傷，成功形成牙周炎合并咬合創傷的復合模型。(3)螺紋釘+Keyes2000牙周炎飼料加自身糞便水喂養復合模型：大鼠左側上頜第一磨牙面中央窩處用車針形成一孔，再植入螺紋釘，使其高出面0.6~0.8 mm，以此造成對創傷。病理切片結果中對牙根、牙槽骨表面破骨細胞數目及牙槽嵴高度降低情況顯示其牙周炎狀況，對此進行分析[32]。

4 結語

牙周炎作為一項廣泛發生的疾病，威脅著人類的健康。以鼠為模型，對牙周炎的致病機制、牙周炎與其他疾病的關系進行研究，獲得了大量的數據和新的進展。但鼠的口腔微生物和人口腔微生物不同，其實驗結果有待進一步的分析及臨床試驗的支持。以鼠為模型的動物實驗已證實或推翻了研究者的部分設想，其實驗結果為研究牙周病的發生發展、其與全身疾病的關系、臨床治療等方面提供了新的思路和方向，也是牙周醫學的發展的重要推動力之一，實驗性牙周炎鼠模型的研究也將繼續發揮其重要作用。