長鏈非編碼RNA在妊娠期糖尿病中的研究進展

譚曉勇，馮春念，幸勇，牟必鴻綜述 馮甜華，張輝，羅茂審校

1.宣漢縣人民醫院藥學部，四川 達州636150；

2.宣漢縣人民醫院檢驗科，四川 達州636150；

3.西南醫科大學藥物研究中心，四川 瀘州646000

妊娠期糖尿病(gestational diabetes mellitus，GDM)是指妊娠前糖代謝正常，妊娠期間發生和發現的不同程度的糖代謝異常，占糖尿病孕婦的90%以上，而糖尿病合并妊娠是指已有糖尿病的患者妊娠[1]。隨著我國人民生活水平的逐步提高，飲食結構逐步發生改變，人們高脂高糖飲食逐步增多，導致妊娠期糖尿病(GDM)在我國的發病率日益提高，GDM正影響著全世界約7%的孕婦。研究揭示，我國2005—2016年GDM的患病率約為13%，明顯高于歐美等西方國家；進一步研究表明，華中、華北、華東地區患病率明顯高于華南、西南、西北地區，且與2005—2012年相比，2012—2016年的患病率顯著升高[2]。越來越多的研究表明，GDM對母子的近期影響主要是導致母親妊娠期間并發癥增加，如妊娠期高血壓疾病、羊水增多；同時容易導致胎兒發育異常、早產、流產、死胎及胎兒感染風險增加等；其對母子的遠期威脅主要是產后母子代謝綜合征尤其是2型糖尿病(T2DM)的患病風險明顯增加[3]。因此，早日診斷和治療顯得更為重要，而探明GDM的病因、發病的分子調控機制及其中的信號通路，研發新的診斷試劑盒及治療藥物則成為重中之重。

長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，lncRNAs)是上個世紀末發現的長度超過200個核苷酸的一類具有特定生物學功能的轉錄物，是基因表達的重要調控因子，具有多種生物學功能，包括順式或反式的轉錄調節、核結構域的組織以及蛋白質或RNA分子水平的調節[4]。研究表明，lncRNAs主要通過沉默X染色體、修飾染色質以及基因組印記、轉錄和轉錄后調控等多個層面調控基因的表達，參與細胞的增殖、遷移和調亡等多種生命體過程，在心血管系統疾病[5-6]、腫瘤[7]、泌尿系統疾病[8]和糖尿病等代謝性疾病中發揮著十分重要的作用。如SHI等[9]通過基因芯片技術檢測妊娠期糖尿病患兒臍帶靜脈血中的LncRNAs的表達情況，結果顯示約有300個LncRNAs明顯上調，800個LncRNAs明顯下調，提示，LncRNAs的異常表達可能在妊娠期糖尿病的發生以及后代出現巨大兒的發育中扮演著重要的角色。為此，本研究簡單介紹了lncRNAs的生物學特征及研究現狀，闡明了lncRNAs與糖尿病發生發展的關系，詳細綜述了lncRNAs在GDM中的研究進展及分子調控機制，展望了lncRNAs未來成為GDM診斷標志物的潛力和研發治療GDM新藥物分子靶點的可能。

1 lncRNAs

人體約有90%的基因轉錄的不具有編碼蛋白質功能的RNA被稱為非編碼RNA。根據長度主要分為長鏈非編碼RNA和短鏈非編碼RNA。由RNA聚合酶Ⅱ合成，經多聚腺苷酸化修飾后，由多個外顯子拼接而成的序列長度超過200個核苷酸的不具有編碼蛋白質功能的非編碼RNA稱為長鏈非編碼RNA；部分LncRNAs有5'帽和3'尾結構，部分有雙莖環、三葉草結構，能在組織、細胞、血液、尿液等中穩定表達。而長度小于200個核苷酸非編碼RNA被稱為短鏈非編碼RNA，主要包括tRNA、microRNA、siRNA等類型[10]。

目前，lncRNAs的分類標準尚未統一，根據其基因組位置，lncRNAs可分為假基因(pseudogenes)、增強子lncRNAs、內含子lncRNAs、天然反義轉錄本(natural antisense transcripts，NATs)和基因間區lncRNAs 5種類型[4]。起初，lncRNAs被認為是基因轉錄的不具有人體生物學功能的“噪音”，而隨著研究者們對lncRNAs功能以及其在人體生命活動中作用的不斷深入研究，尤其是H19和Xist等具有特定功能的lncRNAs的發現，研究者對lncRNAs的研究進入一個嶄新的時期[11]。研究表明，lncRNAs是具有生物學功能的基因轉錄本，在基因沉默、干細胞分化和組蛋白修飾等一系列人體生命活動過程中扮演著重要角色；另外，lncRNAs可作為反式作用因子，在基因轉錄和轉錄后水平參與修飾調控，調節基因的表達。轉錄水平調控主要包括轉錄干擾和染色質重塑。機制主要是：①信號模式，1ncRNAs可作為信號，解讀轉錄因子組合形式或顯示基因調控的信號通路；②誘餌模式，轉錄后和目標蛋白特異性結合，稀釋目標蛋白在體內的濃度并調節其生物學功能；③導向模式，招募修飾染色質的酶到靶基因；④作為支架分子，可以結合多種蛋白質形成核糖核酸蛋白復合物，進而引導相關大分子復合物的組裝[12]。而lncRNAs在轉錄后水平的調控主要包括調節mRNA剪接和蛋白質翻譯：①下調RNA聚合酶的活性，誘導染色質重塑進而調節下游靶基因的表達；②產生內生的siRNA，降解mRNA調控基因的表達；③lncRNAs與特異蛋白結合，形成RNA蛋白復合體，調節蛋白結構、功能和定位[12]。越來越多的研究表明，lncRNAs具有發育階段特異性、疾病特異性、組織和細胞特異性，在不同的組織、細胞、發育階段和疾病中存在特定的表達譜，在調節細胞的增殖、遷移和調亡中發揮著重要的作用。MICHALIK等[13]研究表明，不同組織來源的內皮細胞表達相對較高水平的保守長非編碼RNA MALAT1；在缺氧時MALAT1表達水平顯著增加；進一步研究顯示，通過小干擾RNAs或GapmeRs下調MALAT1的表達，進而抑制內皮細胞的增殖，藥理學抑制可有效降低缺血后的血流恢復以及下調毛細血管的密度。SINGH等[14]評估了LPS對人內皮細胞lncRNAs和mRNAs的影響，結果表明，733個mRNA顯著上調，536個明顯下調，而在差異表達的lncRNAs中，AL132709.5上調幅度最大(約70倍)，CTC-459I6.1下調幅度最大(約28倍)；進一步研究表明，異常表達的lncRNAs可通過TNF信號通路誘導細胞凋亡，加速內皮細胞的損傷。

目前已證實諸如心血管系統疾病、遺傳類疾病、神經系統疾病、癌癥和代謝系統疾病等超過200多種疾病與lncRNAs的異常表達密切相關。LU等[5]研究揭示，與不穩定性心絞痛患者相比，心肌梗死患者的18個lncRNAs顯 著 上 調，35個lncRNAs顯 著 下 調。而ZHANG等[6]研究表明，lncRNA-ROR能通過抑制凋亡相關因子p38/MAPK降低細胞活性，促進細胞凋亡；亦可促進ROS生成，增加NADPH氧化酶活性，加重氧化應激反應，進而誘導心肌梗死。ZHANG等[7]對80例胃癌患者組織進行PCR檢測發現，與癌周正常組織相比，胃癌組織內H19表達水平顯著上調；進一步研究揭示，H19表達水平的改變在胃癌TNM分期、腫瘤的侵襲狀態和淋巴結轉移程度中發揮著重要的作用，且H19的高表達預示著不良的總體生存率。

2 lncRNAs在糖尿病中的作用

研究表明，2015年全球約有4.15億糖尿病患者，患病率近10%，預計到2040年糖尿病患者人數將增長至6.42億；而中國約有1.09億糖尿病患者，預計到2040年將增長至1.51億[15]。

糖尿病、腫瘤和心腦血管系統疾病并稱為世界的三大難癥，且發病的分子機制尚未研究清楚，目前認為環境、飲食、免疫及遺傳因素相互作用，參與調節胰島β細胞的分化、成熟、增殖、凋亡、胰島素分泌和敏感性，進而誘導胰島素分泌不足或產生胰島素抵抗，最終導致患者血糖升高。糖尿病以高血糖為主要的臨床特征，可分為兩種類型：因胰島β細胞破壞而導致胰島素分泌絕對不足，稱為1型糖尿病；2型糖尿病是指胰島素分泌相對不足伴胰島素抵抗。

越來越多的研究表明，lncRNAs廣泛參與細胞增殖、遷移和調亡，與糖尿病的病理發生發展過程密切相關，有望成為此類疾病診斷的生物標記物和治療藥物研發的新靶點。MORáN等[16]采用基因測序技術發現，多達1 100余種lncRNAs在人類胰島中表達，且其中55%為特異性表達，在調節胰島β細胞發育和功能中發揮著重要的作用。提示，lncRNAs可能通過調節胰島β細胞的分化、發育和功能，在糖尿病發生、發展過程中扮演著重要的角色。NICA等[17]采用RNA-seq技術分析發現：胰島β細胞有148個LincRNAs過表達；同時，BRAMSWIG等[18]通過高通量分析證實，有12個LncRNAs在人類的胰島β細胞中特異性表達，5個在α細胞中特異性表達。阮玉婷[19]利用LncRNAs芯片技術分析2型糖尿病外周血LncRNAs的差異性表達，結果顯示，與健康成人相比，2型糖尿病患者外周血中2 270個lncRNAs差異表達，其中379個lncRNAs表達顯著降低，1 891個lncRNAs顯著增加；進一步研究揭示，低表達的Lnc-p34005-v4及其靶基因TCF7L2可能通過胰島素信號通路，參與人體糖、脂代謝的調節，參與2型糖尿病的發生發展。GONZALEZ-MORO等[20]研究表明，胰島β細胞中Lnc13的上調增加了促炎信號轉導和轉錄激活劑1(signal transducerand activator of transcription1，STAT1)通路的激活，從而誘導1型糖尿病的發生，而這與以等位基因特異性方式增加趨化因子的產生密切相關。AKERMAN等[21]研究揭示，lncRNA PLUTO能影響PDX1的局部3D染色質結構和轉錄，PDX1編碼一個關鍵的β細胞轉錄因子，并且在來自2型糖尿病或糖耐量受損的供體的胰島中，PLUTO和PDX1的表達均顯著降低，提示lncRNAs參與了胰島β細胞特異性轉錄因子網絡的調控。ZHU等[22]研究表明，lncRNA MEG3在高脂飲食和ob/ob小鼠中的基因表達顯著上調，過表達的lncRNA MEG3可顯著提升原代肝細胞叉形頭轉錄因子1(FoxO1)、磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(phosphoenolpyruvate carboxykinase，Pepck)mRNA的表達和肝糖原異生，抑制胰島素刺激的原代肝細胞糖原合成，增加胰島素抵抗。GAO等[23]研究揭示，H19在2型糖尿病和存在胰島素抵抗的嚙齒類動物的肌肉中顯著降低，H19作為分子海綿抑制microRNA let-7的表達，導致let-7靶點的表達減少，H19耗竭導致胰島素信號傳導受損和葡萄糖攝取減少。CUNNINGTON等[24]研究表明，調節lncRNA ANRIL的表達能誘導糖尿病等多種人類疾病的發生，同時，SNPs對lncRNA ANRIL和細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑2B(Cyclin-dependent kinase inhibitor 2B，CDKN2B)表達有反作用，支持反義轉錄在CDKN2B調控中的作用。

同時，眾多研究揭示，lncRNAs能誘導糖尿病腎病、糖尿病心肌病、糖尿病視網膜病等糖尿病并發癥的發生。糖尿病視網膜病變(diabetic retinopathy，DR)作為糖尿病患者最主要的致盲原因之一，同時，也是糖尿病微血管病變中最嚴重的并發癥之一。QIU等[25]研究表明，在高糖和氧化應激下，lncRNAs MEG3在STZ誘導的糖尿病小鼠視網膜和內皮細胞中的表達水平明顯降低，而敲除MEG3基因將加重視網膜血管功能障礙，表現為微血管滲漏，毛細血管嚴重變性和炎癥增加，同時，調控視網膜內皮細胞的增殖、遷移及試管形成，而這主要是通過激活PI3k/Akt信號來實現的。THOMAS等[26]研究表明，高糖和糖尿病能誘導HRECs和視網膜lncRNAs ANRIL的表達顯著上調。沉默葡萄糖介導的lncRNAs ANRIL升高能有效抑制VEGF的表達，而這種調節涉及到ANRIL介導的PRC2組分p300和miR200b的調控。

糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)作為引發末期腎病的第二大病因，是發展中國家引起慢性腎衰竭和導致糖尿病患者預期壽命縮短，甚至死亡的主要原因之一。GAO等[27]研究表明，DN患者血清中lncRNA-NR_033515的表達顯著增加，并且與DN的不同階段密切相關，進一步研究表明，lncRNA-NR_033515能促進MMC細胞增殖，并通過miR-743b-5p調節P38、ASK1、纖維結合蛋白、a-SMA、E-鈣黏蛋白和波形蛋白的表達，提示，lncRNA-NR_033515在DN的增殖、纖維化和EMT中的發揮著重要的作用，可能是DN潛在診斷和治療靶點。同樣的調節作用亦在糖尿病心肌病中亦被證實，PAN等[28]研究表明，與非糖尿病對照組相比，6周齡和20周齡db/db小鼠心臟中共有1 479個lncRNAs轉錄本和1 109個mRNA轉錄本異常表達。lncRNAs mRNA共表達網絡分析顯示，BC038927、G730013B05Rik、2700054A10Rik、AK089884和Daw1等5個lncRNAs與差異表達mRNA關聯最為密切，而生物信息學分析表明，這5種lncRNAs與心肌細胞膜去極化、動作電位傳導、心肌細胞收縮和心肌細胞肌動蛋白絲運動密切相關。

3 lncRNAs在妊娠期糖尿病中的作用

GDM是一類妊娠期特有的疾病，指在妊娠期間首次發生或診斷的自發性糖耐量異常，且發病率呈逐年上升的趨勢。據國際糖尿病聯合會(International Diabetes Ederation，IDF)的評估報告顯示，2017年全世界約有14%的孕婦娠期間罹患GDM，表明每年全世界有近1 800萬孕婦受此疾病的折磨[15]。盡管在一般情況下，在分娩后GDM患者的血糖可快速恢復正常，但它顯著增加了妊娠期臨床不良妊娠結局和未來母子罹患2型糖尿病和心血管系統疾病的風險，尤其是GDM可能導致2型糖尿病的惡性代際傳播，影響整個人類的生命健康。提示，探明GDM的發病分子機制、查找GDM診斷的相關生物分子標志物，盡早篩選、識別GDM患者，盡快治療對降低GDM患者不良妊娠結局顯得尤為重要。

近幾年，長鏈非編碼RNA在妊娠期糖尿病發生發展中的分子生物學機制研究成為焦點。CAO等[29]利用微陣列技術發現，84個mRNAs和256個lncRNAs在GDM患者臍血外顯體中的差異表達，且差異表達的mRNAs與胰高血糖素信號通路(GDM相關的重要途徑)有關。H19作為第一個被報道的與妊娠期糖尿病相關的LncRNAs，是一個在胎盤滋養細胞、肝臟和胚胎等組織中高度表達的2 600 nt的多聚腺苷酸化lncRNAs分子，主要表達于細胞質，少量表達于細胞核中[30]。SU等[31]研究表明，在GDM的F1代和F2代中，印跡基因胰島素樣生長因子2(Insulin-like growth factor 2，IGF2)和H19的表達水平顯著下調，這可能是由于差異甲基化區域甲基化狀態異常所致，提示lncRNAs可能通過調節胰島細胞的功能，誘導胰島素分泌受限。

let-7是一種有效的腫瘤抑制microRNA，其功能是在轉錄后抑制調節細胞生長和運動的癌基因的表達，H19則能通過抑制let-7的表達，促進腫瘤細胞的遷移和侵襲，而這與let-7介導的IGF2等轉移促進基因的調節密切相關，提示H19可能通過調控let-7/IGF2軸的表達，參與GDM的發生發展。越來越多的證據表明，H19和IGF2印記基因的DNA甲基化改變與胎兒、胎盤發育密切相關[32]。SU等[33]研究表明，妊娠期糖尿病組(GDM組)臍帶血和胎盤組織中胰島素樣生長因子2的表達均顯著高于糖耐量正常組(NGT組)，而H19在妊娠期糖尿病組臍血中的表達顯著低于正常糖耐量組(NGT組)；進一步研究證實，胰島素樣生長因子2/H19甲基化與宮內高血糖引起的巨大兒之間密切相關。而LAROCCA等[34]研究揭示，產前接觸鄰苯二甲酸鹽和酚類會改變胎盤的印記基因H19和IGF2的甲基化水平，從而在發育過程中對胎盤或胎兒發育產生潛在影響。

轉移相關的肺腺癌轉錄物1(metastasis associated lung adenocarcinoma transcripts 1，MALAT1)是一種編碼基因位于人染色體11q13.1上具有高度保守性的轉錄本約為8 kb的lncRNAs，能通過調節基因轉錄水平、干擾mRNA的切割參與調控人類胚胎發育、腫瘤進程等多種生理和病理過程。ZHANG等[35]研究表明，與正常孕婦相比，GDM患者血清中lncRNAMALAT1的表達水平顯著升高，IncRNAMALAT1的表達與lncRNA p21和lncRNA H19表達水平密切相關，且lncRNA MALAT1可作為GDM診療的潛在血清分子標志物。同時，MIHAILIDOU等[36]研究發現lncRNA p21作為一種細胞周期調節因子能有效抑制胰島細胞增殖和胰島素合成，并通過促進β細胞的再生能力和抑制凋亡等多種機制參與UPR的調節，促進糖尿病的發展。提示，MALAT1可能與通過與lncRNA p21和lncRNA H19相互作用參與調控GDM的發生發展。ZHANG等[37]研究揭示，妊娠期糖尿病患者胎盤組織中lncRNA-MALAT1表達明顯高于正常孕婦，而siRNA干預能通過下調lncRNAMALAT1的表達，抑制炎癥發生和GDM胎盤滋養細胞的增殖、侵襲和遷移，而這可能是通過調節TGF-β/NF-κB信號通路來實現的。李麗等[38]通過實時定量PCR(qRT-PCR)技術檢測發現，重度GDM孕婦組的血清lncRNA MALAT1表達水平明顯低于正常孕婦組。GDM孕婦組血清lncRNA MALAT1表達水平與孕婦分娩時BMI、空腹血糖顯著呈負相關；重度GDM組孕婦的羊水過多、早產、巨大兒發生數及總不良妊娠結局發生數均顯著高于輕度GDM組和正常孕婦組；提示lncRNA MALAT1減少可能是機體抵抗高血糖的保護反應。ZHANG[39]研究表明，與正常孕婦相比，GDM孕婦血清和胎盤絨毛組織中lncRNA MEG3的表達水平顯著升高，用雙熒光素酶報告發現lncRNA MEG3的直接靶點miR-345-3p在GDM孕婦中的表達顯著降低；進一步分析表明，lncRNA MEG3的高表達除了誘導細胞凋亡外，還能顯著抑制HTR-8/SVneo細胞活力，阻止細胞遷移和侵襲；相反，敲除lncRNA MEG3基因能顯著提高HTR-8/SVneo細胞活力，促進細胞遷移/侵襲，減少細胞凋亡。提示，lncRNA MEG3可能通過調節人絨毛膜滋養層細胞生理功能參與GDM的發生和發展，而lncRNA-MEG3可能是GDM的潛在診斷和治療靶點。同時，MEG8被證實在GDM中顯著上調，并可以預測患者腎臟損傷情況。LU等[40]研究表明，循環XLOC_014172和RP11-230G5.2可作為GDM患者巨大兒預后風險的新生物標志物。WANG等[41]研究揭示，HTR-8/Svneo細胞中lncRNA PVT1的表達明顯高于其他癌細胞和HUVEC，而GDM和PE胎盤中PVT1的表達水平明顯低于正常胎盤，能顯著抑制滋養細胞的侵襲性和增殖能力。進一步研究表明，PVT1的過度表達促進了AKT磷酸化，顯著增加了DEGs(GDPD3、ITGAV和ITGB8)的表達；敲除PVT1基因可顯著降低AKT磷酸化并降低DEGs(GDPD3、ITGAV和ITGB8)的表達。FU等[42]研究表明，lncRNAs、microRNAs(miRNAs)和基因可以形成lncRNA介導的前饋環(lnc-FFLs)，而表達失調的lnc-FFLs可以與ceRNAs結合形成更復雜的模塊，在調節GDM糖代謝失調中發揮著重要作用。HUANG等[43]研究表明，在妊娠期喂養HFD的小鼠胎盤中，82個mRNAs和52個lncRNAs差異表達，而性腺脂肪組織中有202個mRNAs和120個lncRNAs差異表達，進一步通過GO分析和基因組通路分析表明，胎盤差異表達的mRNAs與細胞外基質相互作用、消化、黏附和代謝密切相關，而脂肪組織中差異表達的mRNAs則與代謝和胰島素信號通路密切相關。

4 展望

隨著人民生活水平的不斷提高，高質高糖飲食攝取量的逐步增加，諸如妊娠期糖尿病等代謝系統疾病在我國的患病率逐年遞增，而GDM的病因及致病機制尚未完全探明，因此，查明其具體分子機制和信號通路將有助于GDM的診治和易感者的篩選。隨著lncRNAs參與調控胰島細胞功能的分子機制和信號通路的逐步揭示及研究的不斷進展，越來越多的證據表明，lncRNAs廣泛參與胰島細胞增殖、遷移和調亡等功能的調節，在維持胰島細胞結構和功能的穩定中扮演著重要的角色，使得lncRNAs成為潛在的胰島細胞功能調節的標志物，將可用于臨床GDM等諸多代謝系統疾病的診斷、治療和療效評估。目前，關于lncRNAs參與調控腫瘤[7]、心血管系統[5-6]等疾病發生發展過程的機制研究已經比較詳盡，然而關于lncRNAs通過影響胰島細胞功能參與調控GDM發生的病理過程研究還有待進一步完善，這使得更加廣泛和深入的研究GDM相關lncRNAs的上游調控因子以及下游靶基因，全面了解GDM發生和發展相關lncRNAs調控網絡成為當前研究的熱點。

盡管lncRNAs參與調控GDM發生發展過程中的分子作用機制及信號通路研究已取得一定的成效,然而lncRNAs最終研發成為臨床上有效的診療GDM的生物分子標志物還面臨著許多的困難。主要包括：①現有關于GDM與lncRNAs研究較多集中于GDM患者血清和組織中lncRNAs表達譜的差異，且受患病孕婦孕周等內在因素的影響，因此尚需更多更大樣本量的統一患病孕婦孕周的分子機制研究；②GDM是一種特殊類型的糖尿病，病因及機制與糖尿病可能存在一定的相似性，但因懷孕前后飲食方式、結構和孕婦心理等諸多因素改變的影響，又存在一定的可變性，因此查明lncRNAs與GDM的相互作用，還需考慮孕婦飲食和心理等因素的改變是否對GDM患者lncRNAs的差異表達存在一定影響。

綜上所述，lncRNAs與GDM相互關系的研究為當前研究GDM的病因指明了方向，同時也增加了研究GDM分子調控機制的復雜性。lncRNAs為解釋GDM發病機制提供了新的更多可及性，深入研究lncRNAs在GDM中的作用，無疑將為GDM的發病機理提供有益的見解，并產生新的分子靶點，最終可能在臨床應用上取得突破。