比索洛爾對慢性心力衰竭大鼠心肌細胞功能及MAPK/ERK1/2信號通路的影響

馬玉茹，趙琳

（寧夏醫科大學總醫院 心臟中心內科，寧夏 銀川 750004）

心力衰竭是多種原因引起的一種心臟泵功能不全綜合征[1]。從廣義來講，心力衰竭是指在適當的回心血量的情況下心排血量不能滿足機體代謝的需要[2-4]。而慢性心力衰竭是由各種原因引起心臟結構和功能的變化，導致左心室充盈和左心室射血分數（LVEF）降低而引起的一組臨床綜合征，是各種心血管疾病發展的最終階段，也是心血管疾病死亡的主要原因[5]。研究顯示[6-7]，慢性心力衰竭患者5年生存率不足50%。所以，探討臨床治療慢性心力衰竭的有效方法成為研究的重點。目前，β 受體阻滯劑是臨床治療慢性心力衰竭的重要手段[8-9]。比索洛爾是一種β 受體阻滯劑，可以選擇性地阻斷腎上腺素與β1受體的連接來發揮作用[10]。研究顯示[11-12]，比索洛爾可顯著降低重度心力衰竭患者的病死率，但其具體的分子機制有待進一步研究。本研究旨在探討比索洛爾保護功能衰竭心肌細胞的相關機制，以期為更有效的臨床治療提供依據。

1 材料與方法

1.1 動物與試劑

8 ～10 周SPF 級雄性SD 大鼠45 只，體重（220±50）g，購自第三軍醫大學第三附屬醫院野戰外科研究所[動物合格證號：0001517，實驗動物使用許可證號：SYXK（渝）2017-0005]，MAPK 抗體、p-MAPK 抗體、ERK1/2 抗體、p-ERK1/2 抗體購自美國Santa Cruze 公司，HE 染色試劑盒購自上海碧云天生物科技有限公司，比索洛爾購自杭州民生公司（批號：T05F555）。

1.2 模型復制及分組

隨機取15 只大鼠作為對照組，隨機取50 只大鼠用于復制慢性心力衰竭模型。模型復制方法參照文獻[13]，具體方法：腹腔注射阿霉素，單次注射劑量為2.5 mg/（kg·次），2 周內注射6 次，總注射劑量為15 mg/kg。對照組腹腔注射等量生理鹽水。阿霉素首次腹腔注射5 周后，進行超聲心動圖檢查，模型大鼠心腔擴大，左心室短軸縮短率＜30%表明模型復制成功。排除死亡大鼠，共有35 只大鼠模型復制成功。隨機選取30 只模型復制成功的大鼠分為比索洛爾組和模型組，每組15 只，剩余5 只未納入實驗組。比索洛爾組給予比索洛爾灌胃，劑量為0.9 mg/（kg·d），模型組和對照組均給予10 ml/kg 蒸餾水灌胃，連續灌胃35 d。同時，模型組和比索洛爾組繼續腹腔注射阿霉素，1 次/周。

1.3 心功能檢測

給藥結束后，采用超聲心動圖檢測大鼠心功能。檢查前，采用地西泮和氯胺酮進行麻醉，劑量分別為5 mg/kg 和50 mg/kg，腹腔注射。麻醉后用超高分辨率小動物超聲系統（VeVo）進行檢測，指標包括左室射血分數（LVEF）、舒張末期左心室后壁厚度（LVPWD）、收縮末期左心室后壁厚度（LVPWS）、左心室舒張末期內徑（LVEDD）、左心室收縮末期內徑（LVESD）。

1.4 慢性心力衰竭生化指標檢測

采集各組大鼠靜脈血4 ml，采用日立7600-020型全自動生化分析儀（日本日立公司）檢測患者的N 末端腦鈉肽前體（NT-proBNP）、肌紅蛋白（Mb）、心肌肌鈣蛋白（cTnI）及肌酸激酶同工酶（CK-MB），試劑盒均購自南京建成生物有限公司，按照試劑盒說明書步驟操作。

1.5 心肌組織HE 染色

實驗結束后處死大鼠，完整取下心臟組織，常規石蠟包埋，切片，烤片，冷卻后低溫凍存。經二甲苯脫蠟，乙醇梯度水化。蘇木精染色30 ～60 s，沖洗5 min，伊紅染色30 s，沖洗5 min；乙醇梯度脫水，干燥，二甲苯透明，中性樹膠封固，晾干，置光學顯微鏡下觀察。

1.6 Western blotting 檢測MAPK/ERK 信號通路相關蛋白

收集各組的大鼠心肌組織，提取總蛋白，BCA 法檢測蛋白濃度。混合上樣緩沖液，煮沸變性，電泳、轉膜、封閉、一抗二抗孵育、ECL 法顯影定影。通過Quantity One 軟件分析條帶強度，以GAPDH 為內參，檢測MAPK、p-MAPK、ERK1/2 及p-ERK1/2 蛋白的表達水平。

1.7 統計學方法

數據分析采用SPSS 20.0 統計軟件。計量資料以均數±標準差（±s）表示，比較用單因素方差分析，進一步兩兩比較用LSD-t檢驗。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 3 組大鼠的一般情況

對照組大鼠一般狀況良好，進食、飲水及二便正常，無死亡。模型組大鼠在模型復制后，出現明顯精神不佳，進食、飲水量減少，活動量也減少，毛發無光澤。比索洛爾組出現不良癥狀的時間較模型組晚，進食量及飲水量略高于模型組。模型組、比索洛爾組大鼠體重均呈逐漸下降趨勢，但比索洛爾組大鼠體重下降較為緩慢。

2.2 3 組大鼠心臟功能的比較

3 組大鼠心臟功能各指標比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。模型組大鼠的LVEDD、LVESD 較對照組變大（P＜0.05），LVPWD、LVPWS、LVEF 較對照組變薄或降低（P＜0.05）；比索洛爾組LVEDD、LVESD 較模型組變小（P＜0.05），LVPWD、LVPWS、LVEF 較模型組增厚或升高（P＜0.05）。見表1。

2.3 3 組大鼠慢性心力衰竭生化指標的比較

3 組大鼠的慢性心力衰竭各生化指標的比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。模型組NT-proBNP、Mb、cTnI、CK-MB 水平較對照組升高（P＜0.05）；比索洛爾組NT-proBNP、Mb、cTnI、CK-MB 水平較模型組降低（P＜0.05）。見表2。

2.4 3 組大鼠心肌組織HE 染色結果

HE 染色發現，對照組大鼠心肌細胞排列整齊、結構完整、無炎癥細胞浸潤。模型組及比索洛爾組大鼠心室壁顯著增厚，心腔明顯縮小，血管內膜增厚呈明顯的纖維化，心肌細胞結構紊亂，可見炎癥細胞浸潤。比索洛爾組大鼠心肌細胞結構相對完整，與模型組相比，心肌細胞水腫、壞死現象有所好轉。見圖1。

2.5 3 組大鼠心肌組織MAPK/ERK 信號通路相關蛋白表達水平的比較

3 組大鼠心肌組織MAPK/ERK 信號通路相關蛋白表達水平比較，差異均有統計學意義（P＜0.05）。模型組的MAPK/ERK 蛋白的表達水平較對照組升高（P＜0.05）；比索洛爾組的MAPK/ERK 蛋白的表達水平較模型組降低（P＜0.05）。見表3和圖2。

表1 3 組大鼠心臟功能比較 （n =15，±s）

表1 3 組大鼠心臟功能比較 （n =15，±s）

注：①與對照組比較，P ＜0.05；②與模型組比較，P ＜0.05。

組別 LVEDD/mm LVESD/mm LVPWD/mm LVPWS/mm LVEF/%對照組 4.9±0.8 2.7±0.6 1.8±0.4 3.1±0.7 83.5±11.3模型組 9.3±0.9① 8.9±1.1① 1.4±0.5① 1.9±0.5① 34.6±3.1①比索洛爾組 5.8±0.4①② 4.6±0.4①② 1.8±0.5①② 2.6±0.5② 61.3±7.2①②F 值 9.043 14.344 17.405 18.026 17.930 P 值 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000

表2 3 組大鼠慢性心力衰竭生化指標比較 （n =15，±s）

表2 3 組大鼠慢性心力衰竭生化指標比較 （n =15，±s）

注：①與對照組比較，P ＜0.05；②與模型組比較，P ＜0.05。

組別 NT-proBNP/（ng/L） Mb/（μg/L） cTnI/（μg/L） CK-MB/（u/L）對照組 0.2±0.0 40.6±2.7 0.1±0.1 0.8±0.2模型組 7.6±1.6① 145.3±13.7① 0.6±0.1① 4.5±1.5①比索洛爾組 3.0±0.8①② 82.5±5.5①② 0.2±0.0①② 2.3±0.7①②F 值 14.824 24.545 26.013 13.820 P 值 0.000 0.000 0.000 0.000

圖1 3 組大鼠心肌組織染色 （HE×100）

表3 3 組大鼠心肌組織MAPK/ERK 信號通路相關蛋白表達水平比較 （n =15，±s）

表3 3 組大鼠心肌組織MAPK/ERK 信號通路相關蛋白表達水平比較 （n =15，±s）

注：①與對照組比較，P ＜0.05；②與模型組比較，P ＜0.05。

組別 MAPK p-MAPK ERK1/2 p-ERK1/2對照組 0.3±0.1 0.3±0.1 0.1±0.1 0.2±0.1模型組 1.0±0.2① 1.3±0.2① 0.5±0.1① 0.6±1.0①比索洛爾組 0.8±0.1①② 0.5±0.2①② 0.3±0.1①② 0.3±0.1①②F 值 12.983 9.349 14.034 10.870 P 值 0.000 0.000 0.000 0.000

圖2 3 組大鼠心肌組織MAPK/ERK 信號通路相關蛋白表達

3 討論

心力衰竭是指心肌受到嚴重的傷害，無法正常地泵出足夠的血液來滿足身體各個器官活動及代謝的需求，心臟結構逐漸肥大，并無法滿足身體組織、器官的代謝需求，是病態的生理狀況，也可能是任何心臟疾病最終的表現[14]。2016年版的中西醫專家共識共推薦6 類常用西藥治療心力衰竭：包括ACEI 類、β受體阻滯劑、ARA 類、利尿劑、地高辛、血管擴張劑等。螺內酯又稱為比索洛爾，是治療心力衰竭的常用藥物之一，降低了慢性心力衰竭病死率[15-16]。本研究用大鼠復制心力衰竭模型，探討比索洛爾發揮抗心力衰竭的分子機制。

心力衰竭發生后，心肌功能受損，心臟會發生一系列結構改變，微觀層面表現為心肌細胞肥厚、胞外基質及膠原纖維網增生，即“心室重塑”[17-18]。心肌細胞減少使心肌整體收縮力下降；纖維化的增加又使心室順應性下降，重塑更趨明顯，心肌收縮力不能發揮其應有的射血效應，形成惡性循環，最終導致不可逆轉的終末階段[19-20]。本研究發現，與模型組比較，比索洛爾組LVEDD、LVESD 變小，LVPWTd、LVPWS、LVEF 增厚或升高。一些慢性心力衰竭生化指標對判斷患者病情也有一定的指導意義，本研究檢測發現，模型組大鼠的慢性心力衰竭生化指標NTproBNP、Mb、cTnI、CK-MB 水平最高，比索洛爾組次之，對照組相關指標水平均最低。表明比索洛爾有效降低心力衰竭指標水平，抑制炎癥因子的產生，延緩模型大鼠心室重構的進程。HE 染色也證實，模型組及比索洛爾組大鼠心室壁顯著增厚，心腔明顯縮小，血管內膜增厚呈明顯的纖維化。而比索洛爾組大鼠心肌細胞結構相對完整，與模型組比較，心肌細胞水腫、壞死現象有所好轉。

ERK 包括ERK1 和ERK2，是將信號從表面受體傳導至細胞核的關鍵分子[21]。許多其他信號通路明顯活化時，可活化蛋白激酶ERK 信號通路，ERK 明顯活化時，也可活化其他信號通路，從細胞外作用于細胞，至細胞出現相應的生物學效應，通過MAPK 信號轉導通路的三級激酶級聯反應[11]。在信號網絡中MAPK 信號傳遞途徑起著極為重要的作用，控制著細胞多種生理過程，如細胞生長、發育、分裂、死亡等[23-24]，信號傳遞途徑是涉及調節細胞生長、發育及分裂的信號網絡的核心[25]。在本研究中，通過Western blotting 檢測后發現，與對照組比較，模型組的ERK1/2 及p-MAPK蛋白表達水平升高；而與模型組比較，比索洛爾組的ERK1/2 和p-MAPK 蛋白表達水平又相對降低。表明比索洛爾可能通過抑制MAPK/ERK1/2 信號通路，降低心肌自噬活性，發揮心肌保護作用。

綜上所述，比索洛爾能通過抑制MAPK/ERK1/2 信號通路激活，發揮保護心力衰竭大鼠心肌細胞的作用。