鮮雪梅，畢穎超，王珍珍，門燕娟，常佳佳，陳全剛，韓旭峰，鄭葵陽，陳仁金

（1.徐州醫科大學 生命科學學院，江蘇 徐州 221000；2.徐州醫科大學 腫瘤生物治療研究所，江蘇 徐州 221006；3.徐州醫科大學 基礎醫學院，江蘇 徐州 221000）

動脈粥樣硬化是一種對危害人類健康的慢性炎癥性疾病，也是引起老年人死亡的最普遍的原因之一[1]。其特征在于動脈斑塊中膽固醇充盈巨噬細胞的持續存在[2-6]。巨噬細胞是斑塊中最豐富的炎癥細胞類型。在病變中，巨噬細胞感知來自其微環境的信號（例如細胞因子或修飾的脂蛋白）發生表型極化[7-9]，這是一個隨時間變化的動態過程，通過改變自身表型，根據環境信號產生促炎和抗炎作用[10]。真核起始因子4E（eukaryotic initiation factor 4E, eIF4E）在蛋白正常合成的起始階段起重要的調控作用[11-13]，在正常情況下低表達，而在多種癌癥中發生變化[14]。其對細胞的生長、發育、癌癥及神經生物學有巨大影響[15]。eIF4E 翻譯效率的選擇性變化直接導致巨噬細胞分化和活化[16-17]。目前，eIF4E 的表達對動脈粥樣硬化中的影響很少報道。本文采用分子生物學及免疫組織化學法檢測eIF4E 在動脈粥樣硬化斑塊中的表達，以探討其在動脈粥樣硬化過程中的炎癥調節作用，為治療動脈粥樣硬化提供新思路。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

6 ～8 周遺傳背景相同的雄性載脂蛋白E 基因敲除（ApoE-/-）小鼠（購自南京模式動物中心）和C57BL/6J 小鼠（購自北京維通利華實驗動物技術有限公司）各18 只，飼養于徐州醫科大學實驗動物中心，飼養環境符合SPF 要求。

1.2 試劑與儀器

RAW264.7 細胞購自中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心，eIF4E 抗體（小鼠源）購自圣克魯斯生物技術（上海）有限公司，Prime ScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒和TB GreenTMPremix Ex TaqTM購自大連TaRaKa 公司，考馬斯亮藍試劑購自江蘇凱基生物有限公司，CD206（兔源）、CD86（兔源）購自Proteintech 公司（武漢），Alexa Fluor 488（抗鼠）、Alexa Fluor 594（抗兔）購自徐州微科曼得生物工程有限公司。

倒置熒光顯微鏡IX73 購自日本奧林巴斯公司，Leica 冷凍切片機購自德國徠卡公司，電泳儀和凝膠成像儀購自美國Bio-Rad 公司，Centrifuge 5804R 超低溫臺式離心機購自德國Eppendorf 公司，Light Cycler ?480 Ⅱ實時熒光定量PCR 儀購自羅氏診斷產品（上海）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 細胞分組及處理RAW264.7 細胞用含10%胎牛血清和1%青鏈霉素的無菌DMEM 培養基置于37℃、5%二氧化碳培養箱中培養。根據細胞生長狀態傳代并更換新鮮DMEM 完全培養基。調整細胞密度并按每孔約1×106個細胞鋪于12 孔板中，待貼壁后，其中3 孔加入脂多糖（LPS）（終濃度為200 ng/ml），將細胞誘導成M1 型巨噬細胞，為LPS 誘導組；3 孔加入白細胞介素-4（IL-4）（終濃度為20 ng/ml），將細胞誘導成M2 型巨噬細胞，為IL-4 誘導組；對照組不加藥。誘導12 h 后提取RNA。按照同樣的方法將細胞誘導24 h 后提取蛋白，實驗重復3 次。

1.3.2 動物分組及處理將18 只ApoE-/-小鼠和18 只C57BL/6J 小鼠分成6 組，每組3 只ApoE-/-小鼠和3 只C57BL/6J 小鼠，其中C57BL/6J 小鼠為對照組。均喂食高脂飼料16 周后脫頸處死小鼠，心臟灌注5 ml 生理鹽水，將腹主動脈取出后，在體視顯微鏡下將腹主動脈外面的脂肪剝離干凈。其中3 組腹主動脈用于提取蛋白，另外3 組腹主動脈用于提取RNA，提取RNA 時不需要灌注，以免RNA 降解。同時取出ApoE-/-小鼠心臟竇部，用OCT 冷凍包埋劑包埋，置入-80℃冰箱冷凍保存，用于冷凍切片。

1.3.3 Western blotting 檢測eIF4E 蛋白相對表達量分別檢測各組細胞和小鼠腹主動脈中eIF4E 蛋白的相對表達量。采用裂解液（含PMSF）裂解細胞和組織（組織需勻漿），吹打均勻置冰上裂解30 min，4℃、12 000 r/min 離心15 min，取蛋白上清液，考馬斯亮藍法檢測蛋白濃度，剩余蛋白與上樣緩沖液按比例混勻，沸水浴5 min，置入-80℃冰箱冷凍保存。在十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳中進行蛋白分離，冰浴條件下轉至聚偏二氟乙烯膜上。用5%脫脂奶粉封閉1 h 后，加入一抗，4℃搖床孵育過夜。PBST 洗滌4次，加入相應的二抗，孵育1 h 后，PBST 洗4 次，ECL化學發光顯色，成像系統拍照，用Image J 軟件進行圖像分析。以目的條帶（eIF4E）與內參（β-actin）條帶吸光面積積分的比值分析目的蛋白表達。在細胞水平檢測eIF4E 蛋白在M1 型、M2 型巨噬細胞和對照組中的表達；在動物組織水平上檢測eIF4E 蛋白在ApoE-/-和對照組中的表達。

1.3.4 實時熒光定量聚合酶鏈反應（qRT-PCR）檢測eIF4E mRNA 相對表達量分別檢測各組細胞和各組動物腹主動脈中eIF4E mRNA 的相對表達量。采用Trizol 法提取各組細胞和小鼠腹主動脈的總RNA（組織需勻漿），使用Prime ScriptTMRT Reagent Kit with gDNA Eraser 試劑盒逆轉錄成cDNA，用TB GreenTMPremix Ex TaqTM進行qRT-PCR。eIF4E 引物：正向5'-AGGACGGTGGCTGATCACA-3'，反向5'-TCTCTAGCC AGAAGCGATCGA-3'；GAPDH 引物：正向5'-CAACTTT GGCATTGTGGAAGG-3'，反向5'-ACACATTGGGGGT AGGAACAC-3'。以GAPDH 為內參，用2-△△Ct法計算mRNA 相對表達量。所有實驗重復3 次，每次設3 個生物學重復。在細胞水平檢測eIF4E mRNA 在M1 型、M2 型巨噬細胞和對照組中的表達；在動物組織水平檢測eIF4E mRNA 在ApoE-/-和對照組中的表達。

1.3.5 組織免疫熒光檢測eIF4E 與M1 和M2 型巨噬細胞共定位表達將心臟竇部用冷凍切片機切6mm 厚，4%多聚甲醛固定15min，PBST 洗5min/次，洗3 次；0.25% Triton X-100 破膜5 min，5%封閉液室溫封閉1 h；孵育兔源一抗CD206/CD86（兔源，1∶100）和eIF4E（小鼠源，1 ∶300）混合液，4℃過夜；第2 天，先室溫平衡30 min，然后用PBST 洗5 min/次，洗3 次；室溫孵育熒光二抗488（山羊抗鼠，1 ∶100）和594（山羊抗兔，1∶100）混合液1 h，PBST洗5 min/次，洗3次；孵育DAPI 5 min，PBST 洗5 min/次，洗3 次；抗熒光淬滅劑封片，倒置熒光顯微鏡觀察拍照。在組織上檢測eIF4E 在M1 型和M2 型巨噬細胞中的共表達。

1.4 統計學方法

數據分析采用SPSS 26.0 統計軟件。計量資料以均數±標準差（±s）表示，比較用獨立樣本t檢驗或方差分析，進一步兩兩比較用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 eIF4E mRNA 和蛋白在細胞中的表達

對照組、IL-4 誘導組和LPS 誘導組細胞中eIF4E mRNA 相對表達量分別為（1.010±0.157）、（2.102±0.375）和（5.832±0.774），經方差分析，差異有統計學意義（F=23.329，P=0.000），進一步兩兩比較，LPS誘導組eIF4E mRNA 表達高于IL-4 誘導組（P＜0.05）。對照組、IL-4 誘導組和LPS 誘導組eIF4E 蛋白相對表達量分別為（0.130±0.032）、（0.261±0.131）和（0.606±0.134），經方差分析，差異有統計學意義（F=12.834，P=0.011），進一步兩兩比較，LPS 誘導組eIF4E蛋白表達高于IL-4 誘導組（P＜0.05）。見圖1。

2.2 eIF4E mRNA 和蛋白在組織中的表達

對照組和ApoE-/-小鼠腹主動脈中eIF4E mRNA 相對表達量分別為（0.927±0.146）和（6.414±0.297），經獨立樣本t檢驗，差異有統計學意義（t=-33.174，P=0.000），ApoE-/-小鼠腹主動脈中eIF4E mRNA 表達高于對照組；對照組和ApoE-/-小鼠腹主動脈中eIF4E 蛋白相對表達量為（0.225±0.078）和（2.342±0.594），經獨立樣本t檢驗，差異有統計學意義（t=-6.122，P=0.004），ApoE-/-小鼠腹主動脈中eIF4E 蛋白表達高于對照組。見圖2。

2.3 eIF4E 與M1 型和M2 型巨噬細胞共表達

圖1 各組細胞中eIF4E mRNA 和蛋白的表達

ApoE-/-小鼠主動脈根部切片免疫熒光結果顯示eIF4E 與CD86 的共定位比eIF4E 與CD206 的共定位表達多，eIF4E 在M1 型巨噬細胞中的含量高于M2 型巨噬細胞。見圖3。

圖2 各組小鼠腹主動脈中eIF4E mRNA 和蛋白的表達

圖3 eIF4E 與M1 型和M2 型巨噬細胞共表達 （免疫熒光×100）

3 討論

動脈粥樣硬化是一種慢性炎癥，炎癥在動脈粥樣硬化的各個階段都發揮重要作用。在動脈粥樣硬化發展和進展期間，巨噬細胞暴露于許多環境信號[18]。基于其在斑塊內的定位和分布，巨噬細胞展現不同的極化狀態和功能表型[19]。目前，治療動脈粥樣硬化的藥物主要是降脂及抗凝等，但療效不理想，因此仍需從基因水平和細胞分子方面探索動脈粥樣硬化新療法。

真核生物基因表達調控的一種機制是控制翻譯速率，翻譯調控在細胞生長、增殖和發育中起著關鍵作用。可以在翻譯的起始、伸長和終止中的每一步控制翻譯速率[20]。在翻譯起始時，需要大量的真核翻譯起始因子的協作才能完成。其中異源三聚體復合物eIF4F 中的eIF4E 與mRNA 5'-端帽子結構的結合是該階段的核心。已有研究表明，eIF4E 抑制性蛋白能夠通過雷帕霉素復合物1-eIF4E 結合蛋白1/2 軸協調轉錄，從而編碼限制巨噬細胞中抗炎反應的轉錄程序。而eIF4E 通過與eIF4E 抑制性蛋白的結合而破壞翻譯的起始過程，抑制mRNA 翻譯。翻譯抑制已成為炎癥反應的中樞調節機制[21-22]。

本研究用分別LPS 和IL-4 誘導細胞分化成M1型和M2 型巨噬細胞后檢測2 種細胞中eIF4E 蛋白和mRNA 的表達差異，結果表明eIF4E 蛋白和mRNA 在M1 型巨噬細胞中的表達均高于M2 型巨噬細胞。M1型巨噬細胞通過促炎細胞因子等加速免疫細胞內皮下招募和血管壁重塑，M2 型巨噬細胞通過抗炎細胞因子減緩動脈粥樣硬化并使斑塊穩定。初步說明eIF4E主要通過M1 型巨噬細胞發揮促炎作用。在ApoE-/-小鼠動脈粥樣硬化模型中，eIF4E 與CD86 的共定位表達比eIF4E 與CD206 的共定位表達多，且eIF4E 蛋白和mRNA 在ApoE-/-小鼠腹主動脈中表達也高于對照組。動物組織實驗結果驗證細胞實驗結果，進一步說明eIF4E 在動脈粥樣硬化疾病中起促炎調節作用。

綜上所述，eIF4E 通過調控巨噬細胞極化起到炎癥調控作用，其主要是通過調控M1 型巨噬細胞極化起到促炎調節作用。本研究僅從ApoE-/-小鼠動脈粥樣硬化模型做初步研究，后續會通過對小鼠eIF4E 和ApoE 雙基因敲除后，進一步探討其在動脈粥樣硬化的發生、發展中的具體作用以及相關通路，以期為臨床治療動脈粥樣硬化提供一定的理論依據。