吻合口支架降低結(jié)腸術(shù)后吻合口漏發(fā)生率的動(dòng)物研究

敬然 駱洋 秦駿 康紅梅 黃軼洲 俞旻皓 鐘鳴

結(jié)直腸癌全球每年新發(fā)病例約120～130萬(wàn)，占所有惡性腫瘤的10%～15%[1]。在我國(guó)，結(jié)直腸癌的發(fā)病率占全部惡性腫瘤的第5位，且呈上升趨勢(shì)[2]。隨著人們對(duì)結(jié)直腸的解剖生理、結(jié)直腸癌病理和生理學(xué)特性的深入研究以及手術(shù)技術(shù)的精進(jìn)和新輔助治療的出現(xiàn)，結(jié)直腸癌患者的預(yù)后已有所改善，但吻合口漏仍然是圍術(shù)期最主要的并發(fā)癥，如何降低吻合口漏的發(fā)生率成為外科醫(yī)生亟待解決的問(wèn)題[3-4]。導(dǎo)致吻合口漏發(fā)生的危險(xiǎn)因素很多，包括局部因素與整體因素，其中局部因素主要?dú)w結(jié)于腫瘤分期、吻合口張力和血液供應(yīng)障礙等。研究表明，對(duì)于直腸手術(shù)吻合口，留置腸減壓管不僅能降低直腸腔內(nèi)壓力，還減少殘余糞便和腸道分泌物對(duì)吻合口刺激，有利于吻合口的初期愈合，降低吻合口漏發(fā)生率[5]。但是因腸減壓管存在質(zhì)地柔軟、密閉性差等弊端，部分糞便可從腸減壓管與腸壁間縫隙漏出；同時(shí)隨著患者術(shù)后腸蠕動(dòng)的恢復(fù)，極易脫出，從而失去了降低腸腔壓力和隔離吻合口的作用。而由于結(jié)腸手術(shù)吻合口距肛緣較遠(yuǎn)，無(wú)法放置經(jīng)肛腸減壓管，仍缺少降低腸腔壓力、隔離腸道內(nèi)容物與吻合口的裝置。因此，臨床上需要一種既能夠替代腸減壓管的減壓作用，增加吻合口密閉性，又適用于各腸段吻合口的裝置。本研究設(shè)計(jì)的吻合口支架滿足上述臨床操作要求，同時(shí)可在一定時(shí)間內(nèi)自行降解；通過(guò)吻合口支架在SD大鼠中的運(yùn)用，探索吻合口支架對(duì)降低術(shù)后吻合口漏的意義。

材料與方法

一、吻合口支架的設(shè)計(jì)制造

PHA（polyhydroxyalkanoates）是由細(xì)菌發(fā)酵而成的熱塑性聚酯，它涵蓋了一系列由不同單體種類(lèi)構(gòu)建而成的高分子材料，具有優(yōu)良的生物相容性、生物可降解性以及特定彈性[6]。本研究通過(guò)選擇具有特殊單體結(jié)構(gòu)、合適分子量和一定結(jié)晶度的PHA可降解材料，輔以其他共混組分，通過(guò)結(jié)構(gòu)和功能設(shè)計(jì)，制備出具有特殊生物學(xué)功能的PHA基專(zhuān)用吻合口支架。本研究設(shè)計(jì)的支架中部呈管狀，兩端為直徑逐漸增大的喇叭狀開(kāi)口（中間狹窄部位直徑為0.50 cm，喇叭口近端直徑為1.25 cm，遠(yuǎn)端開(kāi)口為1.50 cm，見(jiàn)圖1）。支架兩端呈喇叭狀開(kāi)口，避免了糞便從支架與腸壁間縫隙漏出；支架中央的凹槽將吻合口納入其中，對(duì)吻合口有支撐固定作用，不僅降低了支架脫出風(fēng)險(xiǎn)，而且能防止吻合口狹窄；同時(shí)，支架設(shè)計(jì)材料比較柔軟，從而減輕不適感，提高術(shù)后生活質(zhì)量。

二、實(shí)驗(yàn)對(duì)象

本實(shí)驗(yàn)研究對(duì)象為4～6周齡的健康雄性SD大鼠，體重在280 g～320 g，結(jié)腸直徑約為1.5 cm。將32只SD大鼠隨機(jī)分成兩組，實(shí)驗(yàn)組為支架組（n=16），大鼠平均體重為（294.19±2.56）g；對(duì)照組為手工縫合組（n=16），大鼠平均體重為（294.63±2.87）g，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=0.385，P=0.706）。

圖1 吻合口支架設(shè)計(jì)圖及支架照片

三、建立SD大鼠結(jié)腸端端吻合模型

所有SD大鼠術(shù)前禁食24小時(shí)，禁水12小時(shí)。使用5%水合氯醛腹腔注射麻醉，按照0.7 mL/100 g劑量注射。麻醉后將大鼠四肢固定（見(jiàn)圖2A）。5%PVP碘溶液消毒后取正中切口進(jìn)入腹腔。探查腹腔，在大鼠左下腹找到遠(yuǎn)端結(jié)腸，在系膜側(cè)無(wú)血管區(qū)從系膜對(duì)側(cè)將結(jié)腸離斷，切除3 cm腸段后：支架組將支架分別套入兩側(cè)斷端，使兩側(cè)腸管于吻合口支架狹窄部正中緊密接觸，在結(jié)腸兩斷端用3-0可吸收縫線全層間斷縫合，間斷距離約為0.5 cm，完成結(jié)腸端端吻合；手工縫合組采用全層間斷縫合法吻合，間斷距離約為0.5 cm，漿肌層加固一周（見(jiàn)圖2B）。兩組腹膜層和肌層均采用7號(hào)絲線間斷縫合關(guān)閉皮膚，皮下組織使用1號(hào)絲線間斷縫合。手術(shù)結(jié)束，標(biāo)記后放回鼠籠，每個(gè)籠子4只大鼠。兩組動(dòng)物術(shù)后6小時(shí)麻醉作用消失后給予正常飲水，術(shù)后禁食24小時(shí)，第2天流質(zhì)飲食，第3天開(kāi)始全量飼料（見(jiàn)圖2C）。記錄手術(shù)時(shí)間。兩組大鼠術(shù)后觀察14天，14天后采用空氣栓塞法處死大鼠，觀察兩組SD大鼠腹腔粘連程度，吻合口愈合情況及總體生存率的差異。

四、診斷吻合口漏與評(píng)估腹腔粘連程度標(biāo)準(zhǔn)

吻合口漏診斷標(biāo)準(zhǔn)：大鼠中途死亡或14天處死大鼠后，取距吻合口前后各3 cm長(zhǎng)腸段，遠(yuǎn)端結(jié)扎，吻合口浸入清水中，近端注入亞甲藍(lán)注射液，若有藍(lán)黑色液體溢出則診斷為吻合口漏。

使用腹腔粘連評(píng)分表評(píng)估腹腔粘連情況，參照Bothin等采用的標(biāo)準(zhǔn)（表1）[7]。基數(shù)為1，參照上述標(biāo)準(zhǔn)依次累加得到粘連評(píng)分，對(duì)兩組SD大鼠進(jìn)行腹腔粘連評(píng)分測(cè)定。若大鼠14天內(nèi)死亡則立即剖腹探查計(jì)算腹腔粘連評(píng)分，其余大鼠第14天處死后剖腹探查計(jì)算腹腔粘連評(píng)分。

圖2 建立SD大鼠結(jié)腸端端吻合模型。2A：術(shù)前，2B：術(shù)中，2C：術(shù)后

表1 腹腔粘連程度評(píng)分[7]

五、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料使用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差的形式表示，采用Studentt檢驗(yàn)或者方差分析，生存率分析采用Log Rank檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、兩組SD大鼠術(shù)后腹腔粘連程度對(duì)比情況

將32只4～6周雄性SD大鼠（280 g～320 g）按完全隨機(jī)法分為兩組，每組各16只，實(shí)驗(yàn)組放置吻合口支架，對(duì)照組為手工縫合。實(shí)驗(yàn)組16只大鼠腹腔粘連評(píng)分分別為4、6、4、9、6、7、6、6、5、5、7、10、5、6、5、4，對(duì)照組 16 只大鼠腹腔粘連評(píng)分分別為10、12、9、9、6、11、11、4、12、9、10、9、6、12、9、8。兩組大鼠的平均腹腔粘連評(píng)分結(jié)果顯示：支架組（實(shí)驗(yàn)組）的腹腔粘連評(píng)分（5.94±1.69）分，明顯低于手工縫合組（對(duì)照組）（9.19±2.52）分，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=4.181，P＜0.001），說(shuō)明實(shí)驗(yàn)組腹腔粘連程度低于對(duì)照組（見(jiàn)圖3）。

圖3 兩組SD大鼠術(shù)后腹腔粘連程度評(píng)分。***：P＜0.001

二、兩組SD大鼠術(shù)后吻合口漏發(fā)生率對(duì)比情況

兩組大鼠術(shù)后死亡解剖及術(shù)后14天腹腔探查統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示：支架組（實(shí)驗(yàn)組）的吻合口漏例數(shù)（n=2）低于手工縫合組（對(duì)照組）（n=9），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=6.788，P=0.023），說(shuō)明實(shí)驗(yàn)組吻合口漏發(fā)生率低于對(duì)照組。其中支架組2例吻合口漏分別于術(shù)后第5天和第7天發(fā)現(xiàn)；手工縫合組出現(xiàn)9例吻合口漏，集中發(fā)現(xiàn)于術(shù)后3～8天（見(jiàn)圖4）。

三、兩組SD大鼠術(shù)后總生存率對(duì)比情況

圖4 兩組大鼠術(shù)后吻合口漏例數(shù)

共11只大鼠死亡，其中實(shí)驗(yàn)組2只，對(duì)照組9只。實(shí)驗(yàn)組于術(shù)后第5天、第7天各死亡1例大鼠（n=2，12.5%）。對(duì)照組于術(shù)后第6天、第7天、第8天各死亡1例，術(shù)后第3天、第4天、第5天各死亡2例；實(shí)驗(yàn)組總生存率（87.50%）高于對(duì)照組（43.75%），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=5.850，P=0.016，見(jiàn)圖5）。

圖5 實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組大鼠術(shù)后生存率

討 論

有研究表明，吻合口漏患者術(shù)后圍手術(shù)期的死亡率為15%～45%；而幸存者的盆腔殘余感染和直腸功能障礙的發(fā)生率也明顯增加，從而延長(zhǎng)了住院時(shí)間，增加了住院費(fèi)用[8]。另一些學(xué)者認(rèn)為吻合口漏還與腫瘤的復(fù)發(fā)及術(shù)后結(jié)直腸功能的恢復(fù)密切相關(guān)，對(duì)患者的長(zhǎng)期預(yù)后產(chǎn)生影響[9]。因此，如何降低結(jié)直腸癌患者術(shù)后吻合口漏的發(fā)生率已成為結(jié)直腸外科亟待解決的臨床問(wèn)題。

吻合口漏發(fā)生的直接危險(xiǎn)因素包括吻合口的血供情況、吻合技術(shù)水平、吻合口張力和腸腔內(nèi)壓等[10-12]，間接危險(xiǎn)因素有腫瘤位置（腫瘤位置越低，吻合口的位置越低，吻合口漏可能性就越大）、患者基礎(chǔ)條件（年齡，性別，體型，如肥胖、骨盆窄小等）、健康狀況（糖尿病，營(yíng)養(yǎng)狀況差等）以及術(shù)者的操作熟練程度等[13]。雖然上述因素與吻合口漏的相關(guān)性還有待于進(jìn)一步研究證實(shí)，但針對(duì)危險(xiǎn)因素給予必要的預(yù)防措施仍是國(guó)內(nèi)外臨床工作者和研究者積極努力的方向[14]。回腸造口術(shù)是保護(hù)直腸癌術(shù)后吻合口的經(jīng)典術(shù)式，包括單腔造口轉(zhuǎn)流和雙腔造口轉(zhuǎn)流。由于造口可能并發(fā)皮炎、狹窄、缺血壞死等問(wèn)題且需要二次手術(shù)回納，增加了患者的痛苦及醫(yī)療費(fèi)用，不易為患者所接受[15]。其他方法諸如盲腸置管造口術(shù)[16]、網(wǎng)膜成形術(shù)[17]、纖維蛋白膠水加固吻合口[18]等均未達(dá)到理想的效果。結(jié)直腸內(nèi)旁路技術(shù)是保護(hù)吻合口的另外一種思路。1984年Ravo等[19]首次提出了管腔內(nèi)旁路技術(shù)，在吻合口上方腸管將一軟管與腸道黏膜層縫合，因軟管取材質(zhì)地較硬引起腸管壞死、出血而未有發(fā)展。1994年Yoo等[20]報(bào)道將避孕套代替硅膠管置入腸道，該方法不僅操作繁瑣而且糞便仍然會(huì)漏出避孕套外，繼而污染吻合口。1997年Chen等[21]首次報(bào)道用生物可降解環(huán)固定避孕套置入腸腔進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。

基于上述介紹可知，如何降低吻合口張力、減少腸道內(nèi)容物對(duì)吻合口刺激的難題仍懸而未決，這種尷尬現(xiàn)狀有望通過(guò)構(gòu)建一種新型可降解專(zhuān)用保護(hù)器來(lái)解決。在臨床應(yīng)用方面，目前基于可降解的具有防漏保護(hù)功能的結(jié)直腸內(nèi)旁路專(zhuān)用器件研究少之又少。這種保護(hù)器首先應(yīng)當(dāng)能夠滿足上述臨床操作要求，同時(shí)可在期望時(shí)間內(nèi)自行降解。本研究設(shè)計(jì)的可降解吻合口支架法吻合，通過(guò)隔絕吻合口與腸道內(nèi)容物，使其免受腸內(nèi)容物的應(yīng)力作用和化學(xué)腐蝕等作用，從而給吻合口愈合制造一個(gè)相對(duì)“安靜”的環(huán)境，促進(jìn)了吻合口的早期愈合。吻合口愈合后支架逐漸降解成二氧化碳和水，腸腔內(nèi)無(wú)異物殘留。通過(guò)對(duì)吻合口支架成型模具進(jìn)行特殊設(shè)計(jì)，有機(jī)調(diào)控導(dǎo)管支架的管徑大小、管徑分布，以及管道內(nèi)表面光潔度，使之最大程度契合人體結(jié)直腸解剖結(jié)構(gòu)（尤其是黏膜層和生理功能）。采用具有良好生物活性的PHA材料制備可降解支架，將突破現(xiàn)有研究領(lǐng)域僅使用不可降解高分子材料的現(xiàn)狀。

本研究設(shè)計(jì)的吻合口支架具有以下優(yōu)點(diǎn)：可在手術(shù)中直接放入結(jié)腸吻合口中，無(wú)需通過(guò)肛門(mén)；可自動(dòng)降解，無(wú)需取出；成本較低，有利于緩解患者經(jīng)濟(jì)壓力；設(shè)計(jì)呈喇叭口狀，有利于保護(hù)吻合口，不易脫落。可降解吻合口支架可替代目前臨床應(yīng)用中采用回腸造口保護(hù)吻合口的方式，避免二次手術(shù)還納，減輕了患者的痛苦及醫(yī)療費(fèi)用，易為患者所接受。

本研究通過(guò)建立SD大鼠結(jié)腸端端吻合模型，探索可降解吻合口支架對(duì)降低結(jié)腸術(shù)后吻合口漏的臨床意義。希望通過(guò)本研究，為臨床探索降低結(jié)直腸術(shù)后吻合口漏的方法提供依據(jù)，為將來(lái)臨床應(yīng)用提供一定的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。