成癮的行為學動物模型研究

李佩云，景漫毅，吳寧，宋睿*，李錦*

（1.軍事科學院軍事醫學研究院毒物藥物研究所， 抗毒藥物與毒理學國家重點實驗室， 神經精神藥理學北京市重點實驗室，北京 100850； 2.南京中醫藥大學，南京 210023； 3.解放軍總醫院藥劑科，北京 100850

1 前言

藥物成癮是一種由遺傳和包括成癮性藥物在內的環境因素共同作用于機體引起的一種慢性復發性腦疾病，給成癮者自身和社會造成了嚴重的危害，是重大醫學生物學和社會學問題[1]。令人遺憾的是，到目前為止，國內外尚無理想的抗藥物成癮防復吸的有效藥物及其他干預手段[2]。深入探討藥物成癮的神經生物學機制是尋找防復吸藥物靶點，發現有效的防復吸藥物的重要途徑，而建立具有高臨床代表性的動物模型又是開展藥物成癮神經生物學機制研究的基礎。

藥物成癮的研究整合了廣泛的研究領域，包括社會科學，心理學，精神病學，行為學，藥理學和遺傳學。歷史證明，行為學研究是成癮概念提出的重要依據。在大約一個世紀前，行為學研究對藥物成癮概念的確立，理解成癮的心理學現象發揮了重要的、不可替代的作用。即使在今天，藥物成癮的每一個神經生物學的重大突破都離不開行為學的發現和進展。可以毫不夸張地說沒有行為學的進步就沒有人類對成癮的了解和認知深入。雖然動物模型永遠無法完全再現人類成癮的復雜社會和個體原因，但其仍然能提供高效嚴格的手段來精確描述環境、藥物暴露以及成癮前后機體的行為和認知表現，為客觀研究成癮提供了科學手段[3-4]。

2 藥物成癮動物模型

用動物模型對人類疾病的病因學、發病機制、行為特征和防治進行研究是人類研究疾病的重要的、不可替代的手段。動物模型是指由人類利用動物，在符合動物倫理前提下建立的，可以用來研究人類疾病某一個或幾個特征的特殊有機體[5]。藥物成癮的模型是動物模型的一類，能較好反映臨床藥物成癮的神經生物學、心理學、病因學、臨床治療學的特征或者至少能模仿臨床藥物成癮的某一或某些方面。藥物成癮的動物模型是否理想，主要從可靠性、測試效度、實用性和敏感性四個方面進行評估[6]，其中可靠性和測試效度是最為關鍵的環節。可靠性是指，藥物成癮模型必須允許在標準條件下對自變量（成癮性藥物）進行精確且可重現的操控，并能夠對因變量（成癮性行為）進行客觀且可重現的測量。可將測試效度分為預測效度、病因效度、表觀效度及結構效度四個組成部分。預測效度是指，理想的動物模型應對臨床治療學中有效的藥物表現出療效；病因效度指臨床上具有成癮潛能的成癮性藥物能誘發動物出現類成癮樣行為；表觀效度則是指模型的因變量（實驗動物在成癮情況下的行為）與人體狀況（即病理癥狀）之間的相似性，這在模型設計中尤為重要，但成癮的行為表現在實驗動物和人類之間可能存在很大的物種差異性，造成客觀評價實驗動物的行為輸出與人類藥物成癮行為之間相似性的困難。結構效度是指，模型動物行為表現與成癮患者特定病理過程的心理或神經生物學機制的一致性。基于以上標準，根據操作范式設計的不同，目前廣泛用于成癮研究的動物模型主要分為：自身給藥模型，條件性位置偏愛模型，行為敏化模型，腦電自我刺激模型以及自給光模型等[7-8]。

2.1 自身給藥模型

根據中國精神障礙分類與診斷標準（CCMD-3）及國際疾病分類（IDC-10）的精神與行為障礙類別目錄以及美國精神科醫師協會出版的精神疾病診斷與統計手冊第五版（DSM-V），一般將藥物成癮定義為物質使用障礙（Substance use disorder）[9]。物質使用障礙者核心行為特征是不可控制用藥，具體表現為在一定劑量范圍內藥物使用量逐漸增加、用藥行為不可控和明知用藥會給身體帶來傷害的不可控制用藥；不可控制覓藥，主要表現為對藥物的強烈渴求和不計后果的強迫性覓藥；高復吸傾向。自身給藥模型最顯著的特征是實驗動物通過特定的自主行為操作（壓桿或鼻觸）獲取藥物。根據獲取藥物途徑的不同可將自身給藥模型分為靜脈、口服、腦區自身給藥模型，以靜脈自身給藥模型最為常用。自身給藥模型涵蓋了藥物成癮全過程：①形成：偶然用藥、規律用藥和強迫用藥；②戒斷和消退；③復吸。雖然不同種類的成癮性藥物作用的初始靶點各不相同，但均能通過上調多巴胺獎賞環路（中腦腹側被蓋——伏隔核）神經傳遞功能而產生正性強化（Reinforcement）效應，這是藥物成癮的起始機制，維持規律用藥的內在動力。隨著訓練時間的延長和用藥量的增加，操作性行為的條件化作用導致了行為反應增加，使得用藥行為由原來的目標導向性行為轉變為刺激反應行為，也就是通常所說的強迫性用藥行為。中腦邊緣皮質多巴胺系統的關鍵核團，中腦腹側被蓋、伏隔核以及前額葉皮層等發生可塑性改變成為介導行為長期維持的神經解剖學結構基礎。在經過戒斷消退后，相關藥物、線索及應激條件下可通過激活發生可塑性改變的核心腦區伏隔核誘發復吸覓藥行為的出現[10-11]。因此，基于以上研究基礎形成了自身給藥模型的構建原理。

自身給藥模型最初是在非人靈長類動物中發展起來的[12]。1962 年Weeks 開創性地成功建立了大鼠靜脈嗎啡自身給藥模型[13]。在固定比率程序下將嗎啡注射到活動相對自由的大鼠中，大鼠很快建立了壓桿操作行為與獲得嗎啡的關系，實現了通過壓桿或者觸鼻獲得藥物。事實上，除了致幻劑（LSD）[14]，其他成癮性藥物均可以誘導動物建立自身給藥行為。因此，該模型較好地滿足預測效度、表觀效度和結構效度。在預測效度中，成癮性物質均能誘發動物和人類的自主用藥行為，通過自身給藥實驗能夠預測潛在成癮物質的成癮閾值及特征（如渴求的程度，即用藥次數），并且可用來評價抗成癮物質對抗成癮的藥效學作用。在表觀效度中，該模型中實驗動物的用藥及覓藥行為與人類表現相似[15]。成癮者主要通過靜脈或黏膜吸收形式獲得成癮性藥物，動物則可通過自主鼻觸或壓桿觸發藥物注入靜脈，或者藥物（酒精）釋放到食槽中通過口服飲用。在結構效度方面動物成癮的機制與人類的相似，這是研究成癮機制和治療成癮最重要的方面。如上所述，成癮性藥物的強化作用是導致動物和人類自主用藥的根本原因，在強化作用的驅使下，隨著藥物的反復使用，出現中樞神經系統的病理改變，同時藥物渴求逐漸強化，用藥次數、劑量逐漸增加，最終演變成難以控制的強迫用藥、強迫性覓藥行為[16]。

自身給藥的訓練程序包括固定比率給藥和累進比率給藥[17]。固定比率（Fixed ratio, FR）給藥是指動物每完成一次或一組固定的操作次數（觸鼻或壓桿）后就能得到一次藥物（FR1：壓桿1 次獲得1 次藥物注射；FR2：壓桿2 次獲得1 次藥物，以此類推）。該程序反映了實驗動物的操作反應能力和藥物獲得之間的直接關系，即揭示了成癮性藥物本身的強化作用。而累進比率（Progressive-ratio，PR）給藥，則指動物每次獲得藥物的操作數量成倍數或指數級遞增，即：1，2，4，6，9，12，15，20，25，32，40，50，62，77，95，118，145，等，而斷點（Break point）則是該程序的評價指標，即動物獲得最后一次藥物所付出的最大的勞動量。該程序得到的斷點主要反映被測成癮性藥物成癮潛能的高低，在一定程度上也可反映動物的覓藥動機的強弱。

目前在評價藥物的潛在成癮性或者抗成癮藥效學作用的研究中，通常以嚙齒類動物為研究對象，采用FR 給藥程序（每天訓練1 次，每次2～4 小時，訓練14天）或PR 給藥程序（在FR 程序訓練達到穩定的自身給藥基礎上，每天訓練1 次，每次不少于6 小時），給予不同劑量的待評價藥物觀察是否能夠誘導嚙齒類動物的自身用藥行為從而確定其強化作用的程度（潛在成癮性）或者改變成癮性藥物誘導的自身給藥行為（抗成癮），及對應的量效關系。

上述訓練流程設計僅凸顯成癮性物質的正性強化作用，并不能反映出強迫性用藥和強迫性覓藥的特征，Clark 等人發現缺水的猴子同樣可以形成靜脈（頸內）自我給予鹽水注射的行為[18]，因此并非真正意義上的“成癮”。設計出更符合成癮核心特征的模型更利于揭示成癮的行為藥理學或者神經生物學機制，這就要求對動物的持續用藥或覓藥的強迫性程度進行量化。Koob 和Everitt 設計了長時程（Extended access 或Long access）的自身給藥訓練流程（每天訓練一次，每次訓練從2小時提高到6 小時以上），或者延長自身給藥的訓練周期（Prolonged 或Extended access，每天訓練一次，連續訓練50 天以上）[19-20]，隨著訓練時程或周期的延長，實驗動物的用藥行為呈現遞增反應。而短時程訓練組（Short access，每天每次訓練不大于2 小時，訓練周期不多于25 天）則通常會達到相對穩定的用藥行為平臺期，每天用藥量無顯著性的變化。

但長時程用藥的訓練程序也存在一定的局限性，無法體現在無藥可用狀態下的強烈渴求狀態和強迫性覓藥行為，而后者才是誘發復吸行為的主要心理機制[21]。因此，根據結構效度的要求需要區分用藥與覓藥的狀態并進行量化比較，即最大限度地避免由藥物本身引起的興奮或鎮靜的干擾，對覓藥程度進行定量分析。雙鏈異質取藥強化程序（Two-link heterogeneous chain schedules of reinforcement）[22]和二級強化程序（Secondorder schedule of reinforcement）[23]為解決這一問題提供了較為理想的實驗方法。

2.1.1 雙鏈異質取藥強化程序

該程序中設置覓藥壓桿（壓桿后無藥物注射）和獲藥壓桿（壓桿后有藥物注射）。在FR1 給藥程序下訓練流程分為兩步進行。首先程序開始后只出現獲藥踏板，訓練動物獲得穩定的自身用藥行為。隨后開始引入覓藥踏板進行雙鏈異質測試，此時獲藥踏板收回，覓藥壓桿出現，動物通過壓覓藥桿后隨即啟動隨機時間間隔（Random interval, 60～120 秒），RI 結束后覓藥壓桿收回，獲藥壓桿伸出，蹬該踏板即可獲取藥物注射，隨即進行固定時間的不應期（15～20 秒內壓動獲藥壓桿不能獲取藥物注射）。不應期結束后，獲藥桿收回覓藥桿出現開始下一輪的訓練。該模型所設置的不同壓桿較好地區分了覓藥和用藥行為，通過檢測尋找覓藥壓桿的潛伏期、壓桿數量或響應率，以及尋找取藥壓桿的潛伏期和壓桿數量較理想的分離了渴求狀態和目標獲取行為。采用該程序研究發現在可卡因自身給藥早期即短時程訓練后，獲藥桿行為顯著高于覓藥桿其行為不依賴于背外側紋狀 體[4，8]；但隨著訓練的延長，覓藥桿的尋求行為顯著升高，并失去對獲藥桿的興趣即對藥物作用本身追求降低成為習慣性/強迫性行為，該行為依賴于背外側紋狀體的失活[24]。因此，該程序清晰明確地反映了成癮者的渴求狀態，為揭示成癮的強迫性行為的神經生物學機制提供理想的動物模型。

2.1.2 二級強化程序

成癮相關環境線索是誘發復吸的最危險因素[25]。所謂線索也被稱為二級強化物，即中性刺激被賦予獎賞激勵價值的特性[26]，其是成癮患者在無藥可用狀態下覓藥行為形成、維持、消退和誘發的基本元素[27]。因此研究線索在藥物成癮中的調控作用為闡明成癮復吸的神經機制就顯得尤為重要。在上述自身給藥訓練程序中，線索與藥物同時出現無法排除藥物的直接藥理作用，而在異質鏈訓練程序中雖然探究了覓藥狀態，卻無法體現線索條件性刺激的二級強化作用。因此，模擬和建立高臨床特征的無藥可用狀態的覓藥行為不僅要分離成癮性藥物的直接藥理學效應，而且需要深入解析動物在線索條件性刺激的影響下按壓杠桿以尋求藥物的行為，從而真正反映成癮者的渴求狀態。二級強化（Second-order schedules）的自身給藥程序設計中，重點研究了實驗動物對二級強化物（即條件性線索）而非藥物本身進行反應，在表觀效度上更具有臨床指導意義。

首先采用固定壓桿次數（FR）或者固定時間間隔（Fixed interval, FI）程序訓練動物在獲得藥物注射的同時伴隨燈光等條件性線索的呈現，建立穩定的自身給藥行為。然后進行二級強化程序的訓練，不同于第一階段的訓練，該程序中將FI 和FR 進行組合，通常有四種組合 FI（FR：S）、FR（FI：S）、FI（FI：S）、FR（FR：S），其中S（Stimulation，表示線索出現）。FI（FR：S）組合的使用最為廣泛，比如FI 10 min（FR3：S）中，子程序是FR3，即實驗動物每壓杠或者觸鼻3 次呈現一次S（如燈光、聲音等），10 min 后，呈現S 的同時給予成癮性藥物。經過該程序的訓練，動物通過壓桿獲得的是二級強化物條件性線索而非藥物本身，更為準確地反映了覓藥行為。研究發現，線索匹配組動物的壓桿行為相對于無線索刺激組顯著增高[28]，撤掉或改變條件性線索動物的壓桿行為顯著降低，而線索再次出現壓桿行為則快速恢復[29]。因此，二級強化自身給藥模型揭示了線索是促進動物成癮覓藥行為的充分必要條件，更準確模擬了人類成癮行為中相關線索的重要作用。

綜上所述，自身給藥模型較好地滿足了可靠性和測試效度的有效標準，為研究成癮的提供高臨床特征的動物模型。然而其也存在一定的缺陷，靜脈插管在長時間的實驗訓練過程中經常發生堵管、漏液、導管脫落以及嚴重感染等問題，導致實驗數據采集中斷及樣本量的缺失[30]。因此，手術和訓練維護的難度是該模型的主要瓶頸。

2.2 自給光模型

光遺傳學技術被認為是21 世紀神經科學領域最引人注目的技術革新[31]，通過在神經細胞中表達光敏蛋白，響應不同波長的光刺激實現對神經細胞的實時調控和記錄，具有獨特的高時空分辨率和細胞類型特異性兩大特點[32]，突破了精準地探究特定神經環路和大腦功能與行為之間的直接因果關系的技術壁壘。在神經科學領域得到了飛速的發展，在成癮[33]、學習記憶[34]、睡眠障礙[35]、帕金森癥模型[36]等多個神經精神疾病中得到廣泛應用。

目前研究認為中腦邊緣皮質的多巴胺獎賞中樞在是驅動成癮的始動因素，其中多巴胺（Dopamine, DA）神經元則是介導其作用發揮的最重要神經結構物質基礎[37]。因此借助于光遺傳學技術可實現多巴胺神經元進行實時操控結合自身給藥操作范圍可為揭示成癮的致病機制提供理想的動物模型[38]。首先將光激活蛋白特異性地表達在中腦腹側被蓋區（Ventral Tegmental Area, VTA）的DA 能神經元上，將刺激光纖埋置VTA 腦區訓練小鼠自給光行為[39]。隨著激光刺激強度和時間的延長，其壓桿或者觸鼻行為顯著升高[40]；在訓練過程中，自給光用藥行為強的小鼠在經歷電擊等不可避免的負性刺激后仍然保持自給光行為；經過消退訓練后，線索可顯著誘發覓光行為的重建[39，41]。刺激VTA 的DA神經元建立的自給光模型復制了成癮的核心特征：不計后果的強迫性用藥行為以及復吸行為。因此自給光模型可作為成癮研究的行為學范式，有助于理解和闡明非物質成癮形式（如性成癮、網絡成癮等）背后的神經機制。本實驗室采用該技術建立的自給光模型，科學解析了成癮所涉及的神經元類型及多巴胺神經投射通路特定環 路[42]，為成癮的治療策略提供新視野和新方法。

2.3 條件性位置偏愛模型

條件性位置偏愛模型（conditioned place preference, CPP）是指，將兩種不同的非條件刺激（藥物注射）與兩種不同的環境（條件性線索）配對，環境線索的空間配置、顏色、地板，甚至嗅覺線索盡量保持不同。然后在不同的環境中分別給動物注射藥物或對照溶劑，進行條件性匹配。在CPP 的形成階段，根據拉丁方和無偏設計將對實驗環境線索無偏性實驗動物進行藥物與環境的匹配訓練。然后在無藥物注射的情況下，受試對象被允許進入兩個隔間，如果受試對象對藥物配對環境產生了偏好，則表明藥物具有獎勵特性使得環境線索成為條件性刺激而被賦予了獎賞價值。所以，CPP 就是基于巴甫洛夫條件刺激學習記憶原理而設計的[43]。1976年，Rossi 和Reid 就報道了基于CPP 現代范式的第一項研究[44]，盡管早在20 世紀40 年代就已發表了關于非人靈長類嗎啡慢性處理后展現了對藥物配對環境的偏 好[12]，但該研究對非條件性刺激和條件性刺激并未做嚴格的對照，無法排除動物的天然偏好對CPP 實驗結果的影響。Rossi 和Reid 將停留時間作為實驗動物的偏好指標，到目前為止該實驗流程已被大家認同，并且不斷進行修改和完善，自20 世紀80 年代以來CPP 模型在藥物成癮研究領域得到廣泛應用。

盡管一些研究者認為CPP 是尋求藥物行為（或藥物渴望）的模型，其本質上依賴于巴甫洛夫關聯，因此單純的CPP 不能解釋藥物尋求和用藥行為，這可能是自身給藥模型更具優勢的原因。然而，相比較于自身給藥等操作式強化動物模型，CPP 自身也具有獨特的優 點，比如受試對象是在植物性神經系統支配下進行的行為反射，是一種低級的反射活動，無須太多的學習和訓練，實驗周期短，簡單易行且廉價[45]。因此，CPP 模型也能滿足預測效度、表觀效度和結構效度的要求，可廣泛應用于成癮研究。

2.4 行為敏化模型

在動物模型中，成癮性藥物直接或間接引起多巴胺升高引起的動物活動性升高是其興奮性作用的直接表 征[46]。那么根據成癮性藥物的作用特點，行為敏化模型是指，在反復或固定間隔給予成癮藥物會導致的運動行為的逐漸增加[47]。然而，精神運動行為的增加并非簡單的活動性的升高，而是需要對行為反應的各個組成部分進行表征，因為藥物對行為的影響可能存在競爭關系，因此其具體表現應視不同環境和動物種屬而有所不同，如成癮研究中常用的嚙齒類動物，表現為在相對狹窄封閉的環境內水平和豎直運動量的增加，或者反復小幅度刻板運動（如咀嚼、搖頭等） 的增多，在試驗中常以自發活動模型或旋轉行為模型來測量[48]。刻板行為的增加勢必影響活動度的升高，因此對于行為敏化的分析要進行多維度的測量[49]。

行為敏化模型是基于“激勵敏化”理論[50]，該理論認為，藥物成癮的本質是心理“需求”的過度放大，尤其是由線索引發的心理“需求”，而不一定是“喜好”的放大，這是因為易感個體與多巴胺相關的動機系統發生了長期的變化，即神經敏化。早20 多年前，對于動機敏化理論最大的爭議在于，沒有證據表明人類表現出行為或神經過敏[51]。而近10 年的研究發現，反復間歇性地給予苯丙胺后，人類可產生持續的行為的致敏作用（例如，眨眼反應，活力和能量升級），在苯丙胺高劑量給藥時表現的尤為顯著[52]。與此同時，即使停藥一年后給予苯丙胺仍能引起人體內多巴胺的敏感性釋放，并且相關線索也會在與獎勵相關的大腦結構中引起強烈的多巴胺反應[53]。此外，在吸毒成癮者中，通過眼動追蹤注意力的檢測中，成癮患者更傾向與毒品線索的追蹤，并且以與激勵敏化一致的方式吸引注意力[54]。綜上所述，人類的成癮致敏理論也逐漸得到廣泛的認同。因此，行為敏化模型具有良好的結構效度，并且操作簡單易行，實驗周期短，是研究成癮機制和藥物成癮潛能和抗成癮藥效評價的良好模型。

2.5 腦電刺激模型

20 世紀50 年代，來自麥吉爾大學的Olds 和Milner Olds 兩位科學家研發的顱內自我電刺激的實驗模型發現了腦內的獎賞中樞系統，這一里程碑的發現標志著成癮神經機制研究的一個重要轉折點[55]。該模型的基本操作原理是通過將電極直接插入特定部位如腦內側前腦束，然后將大鼠放入經典的斯金納操作性條件反射箱中，大鼠通過不斷地壓桿獲得電刺激，該行為被稱為正性強化行為。因此確定了獎賞中樞的神經解剖位置及物質基礎，即從腹側被蓋區到伏隔核，嗅結節，杏仁核，眶額皮層以及內側前額葉皮質，其中多巴胺神經遞質是有效的物質基礎，這引發了人們對大腦中多巴胺系統相當大的興趣，認為其獎勵屬性是天然物質（食品）和成癮性藥物的強化基礎[11，56]。該模型的設置，為自身給藥模型的建立打下了良好的實驗基礎。與自身給藥模型不同的是，該模型通過不同的電流刺激表征個體大腦的獎賞刺激閾值，通過壓桿行為能夠靈敏地量化藥物的欣快或厭惡效應，并且可測量成癮戒斷過程中所產生的煩躁程度。因此，該模型也具備了良好的表觀效度和預測效度可靈敏地檢測和評價未知藥物的獎賞效能和潛在成 癮性。

3 結語

藥物成癮作為慢性復發性的神經精神類疾病，不同于腫瘤、心血管等疾病，其發病和診療均具有特殊性。因此，研究和建立穩定、可靠的高臨床特征動物模型成為研究疾病的關鍵環節。成癮作為一種獨特的人類現象，而單個模型只能捕捉成癮某個階段的特性，因此就需要在多種模型中進行互相印證，才有可能全面系統地揭示藥物成癮的行為藥理學和神經生物學基礎。在未來，不斷完善成癮的臨床前動物模型，不能僅限于藥物強化或神經生物學適應性研究，還需要包括通過反復接觸成癮性藥物（長時程用藥）來模擬成癮患者的強迫性用藥特質，而該特征也正是不同體系診斷標準所強調的。只有多管齊下，優勢互補才能為深入理解成癮的病因和病理生理學提供新的見解。