實時熒光定量PCR法在手足口病中的診斷價值

李文瑞 葉敏南 何月敬 梁健行 呂 芬 黎四平 張耀忠

1.廣東醫科大學附屬東莞兒童醫院檢驗科，廣東東莞 523320；2.廣東省東莞市兒科研究所，廣東東莞 523320

手足口病在醫學上較為多發，它主要是由腸道病毒感染而導致的傳染性疾病，近年來的臨床調查發現此病癥已成為兒童的常見疾病之一[1-2]，發病時間主要集中在春夏季，尤其是男童的數量明顯多于女童，但年齡越大的兒童，發病會越少[3]。其臨床癥狀主要表現為厭食、低熱、口腔、手部及足部出現小潰瘍，大部分兒童在患有手足口病后會自行康復，但也有少部分兒童的病情會進一步加重而引發肺水腫和心肌炎等并發癥，嚴重時還有可能導致兒童死亡[4-5]。臨床對手足口病的診斷依靠已經出現疾病或癥狀來判斷，癥狀不明顯時會導致漏診，影響治療，因此選擇一種安全有效的方式對其進行診斷，對于兒童的康復來說極為重要, QPCR 檢測是臨床上常見的一種檢測方法，本研究采用實時熒光定量PCR（QPCR）法檢測手足口病，評價其臨床價值，現將實驗結果報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2019 年1—12 月我院手足口病兒童163 例作為本次研究的試驗組，其中女72 例，男91 例，年齡13 d ～8 歲，平均（4.7±2.9）歲，該組患者均符合《兒科手足口病理學診斷規范》中相關病癥的診斷標準[6]，其基本資料均完整登記。選取同期在我院體檢的161 例兒童作為對照組，其中女74 例，男87例，年齡21 d～7歲，平均（5.2±1.7）歲。

納入標準：①年齡在8 歲以下的兒童；②有手、口腔等出現皰疹且疑似手足口病的有關癥狀兒童；③完善腸道病毒PCR 相關檢查的兒童。排除標準：①存在基礎性疾病或嚴重精神障礙的兒童；②有其他病毒性感染兒童；③未完善腸道病毒PCR 相關檢查的兒童。兩組兒童一般資料比較差異無統計學意義（P＞0.05）。

1.2 儀器與試劑

實時熒光定量PCR 檢測采用ABI7500 熒光定量PCR 儀（美國賽默飛）對CoxA16、EV、EV71 進行檢測，擴增反應條件：40℃ 25 min，1 個循環；94℃ 3 min，1 個循環；93℃ 15 s，55℃ 45 s，40 個循環。試劑采用中山大學達安基因股份有限公司原裝試劑。

1.3 方法

標本采集：采集兒童糞便標本6 ～9 g，立即放入專用采便管內，0 ℃冰壺保存，30 min 內送檢。核酸提取及檢測等所有操作均說明書進行，操作人員都取得相應資格證。陽性結果需同時滿足下列3項：①陰性質控品。無典型S 型擴增曲線或無Ct 值；②陽性質控品。呈典型S 型擴增曲線且Ct ≤30；③檢測樣本結果呈S 型擴增曲線且Ct 值≤34.9。

1.4 統計學處理

采用SPSS 17.0 對實驗數據進行分析處理，計數資料用[n（%）]表示，采用χ2檢驗，計量資料用（）表示，采用t檢驗，以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

試驗組163 例兒童中實時熒光定量PCR 檢測陽性144 例，其中女61 例，男83 例，陽性為144 例（88.34%），對照組161 例兒童中陽性3 例，陽性為3 例（1.86%），兩組比較差異有統計學意義（χ2=21.873，P=0.000 ＜0.05）。對 照 組144 例 手足口病患兒中主要以腸道病毒EV 為主，有102 例（70.83%），其次是CA16，有33 例（22.92%），最后是EV71，有9 例（6.25%）。

3 討論

手足口病是由于腸道病毒感染而導致起的兒童傳染病，潛伏期大約為1 周左右[7-8]，其發病時間分布較為廣泛，并且不存在明顯的地區性，每年的春夏秋冬均有發病的可能，但在我國以夏秋季為高發季節，在疾病的爆發期間，托兒所及幼兒園呈現集體感染，其具有極強的傳染性，主要通過患者的咽喉分泌物、皰疹液、唾液、糞便進行傳播，能夠在短時間內形成較大的規模流行[9]。我國目前出現手足口病的兒童年齡通常在5 歲以下并且以男童為主[10]，而大部分兒童的發病時間都在每年的5—10 月，兒童的發病持續時間通常在2 ～7 d，尤其是2 ～4 歲的兒童發病率最高，隨著兒童年齡的增長，發病率會逐漸降低[11]。有文獻報道腸道病毒中的EV71 病毒感染兒童，隨著其感染癥狀的不斷發展，會出現較為明顯的神經系統并發癥[12-13]，具有較大的危害性以及致死率。

QPCR 技術是核酸檢測中常用方法，這種技術不僅具有普通PCR 的高靈敏性，并且在檢驗過程中將熒光探針應用于其中，同時具有DNA 雜交的高特異性和光譜技術的高精確性[14]，檢測過程中總時長大約2.5 h，加快了檢測時間，對于手足口病患者的確診及治療提供了相應的證據，也為患者后續的治療工作開展提供了參考依據[15]。在本研究結果中顯示試驗組163 例兒童中QPCR 檢測陽性144 例，陽性率為88.34%，對照組161 例兒童中陽性3 例，陽性率1.86%，兩組比較差異有統計學意義（P＜0.05），對照組有3 例陽性可能是癥狀不明顯的手足口病。我們研究還發現，手足口患者中主要以腸道病毒EV 為主，有102 例（70.83%）。因此將QPCR 檢測方案應用于手足口病的檢測中，患兒的診斷陽性率與實驗室病理檢查結果無明顯差異。

綜上所述，實時熒光定量PCR 對手足口病的早期診斷有較高的臨床價值，對于后續的治療工作有積極意義，值得臨床上推廣使用。