線粒體離子肽酶1的結(jié)構(gòu)與功能及其在常見惡性腫瘤中的表達(dá)和作用

吳曉涵 陳紹水

濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院腫瘤科，山東濱州 256600

線粒體提供了細(xì)胞生命活動(dòng)所需能量的80%，被喻為機(jī)體的“能量工廠”，維持線粒自身的穩(wěn)態(tài)是保證機(jī)體細(xì)胞正常活動(dòng)的基礎(chǔ)。作為細(xì)胞能量和代謝的中心，線粒體可通過氧自由基清除、蛋白水解系統(tǒng)、蛋白酶體系統(tǒng)、線粒體裂變和融合及線粒體自噬[1]等方式維持自身穩(wěn)定。其中，線粒體離子肽酶1（lon peptidase 1，LONP1）是保障線粒體功能和蛋白質(zhì)穩(wěn)定的主要蛋白酶之一。LONP1蛋白于1981年在大腸桿菌中被首次發(fā)現(xiàn)[2]，后于1993年被Kutejova等[3]在酵母菌中分離。此蛋白由6個(gè)亞基組成，包含963個(gè)氨基酸，相對(duì)分子質(zhì)量為106 000[4]。作為一種細(xì)胞核內(nèi)脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）所編碼的線粒體酶，LONP1蛋白在整個(gè)進(jìn)化過程中高度保守[5]，它參與了線粒體中正常蛋白質(zhì)的折疊、異常蛋白質(zhì)的降解和DNA的維護(hù)。近年來許多研究表明，LONP1蛋白可受到多種刺激的誘導(dǎo)并提供針對(duì)細(xì)胞應(yīng)激的保護(hù)。LONP1蛋白的上調(diào)與下調(diào)與多種疾病的發(fā)生與發(fā)展密切相關(guān)。本文將對(duì)LONP1蛋白的結(jié)構(gòu)和功能及其在常見惡性腫瘤中的表達(dá)和作用進(jìn)行綜述。

1 LONP1蛋白的結(jié)構(gòu)

LONP1蛋白是由LONP1基因所編碼的腺嘌呤核苷三磷酸（adenosine triphosphate，ATP）依賴蛋白，該蛋白位于人19號(hào)染色體上，是“與多種細(xì)胞活動(dòng)相關(guān)的ATP酶”超家族的重要成員[6]。成熟的LONP1蛋白位于線粒體基質(zhì)內(nèi)，占蛋白總量的90%；剩余10%為未成熟的蛋白，它們與線粒體內(nèi)膜鑲嵌[7]。LONP1蛋白由細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)穿過線粒體雙層膜結(jié)構(gòu)進(jìn)入線粒體基質(zhì)需要線粒體靶向序列（mitochondrial targeting sequence，MTS）引導(dǎo)，該序列在細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)與LONP1蛋白結(jié)合，引導(dǎo)其進(jìn)入線粒體基質(zhì)。當(dāng)LONP1蛋白修飾成熟后，MTS被從蛋白上剪切，此時(shí)LONP1蛋白的相對(duì)分子質(zhì)量由106 000減至100 000[8]。

LONP1蛋白在細(xì)菌和人線粒體中形成六聚體結(jié)構(gòu)，這種結(jié)構(gòu)在Mg2+存在時(shí)形成傾向較為強(qiáng)烈，但不因Mg2+的缺乏而崩解。此外，這種中心空腔的六聚體結(jié)構(gòu)的形成與ATP無關(guān)[9]。在酵母菌等真菌中，LONP1蛋白呈現(xiàn)環(huán)狀七聚體結(jié)構(gòu)，這種結(jié)構(gòu)在無ATP存在時(shí)會(huì)變形扭曲，這可能與LONP1蛋白的水解活性及分子伴侶功能有關(guān)，具體機(jī)制尚不清楚[10]。

LONP1蛋白內(nèi)部由3個(gè)結(jié)構(gòu)域組成：①N端結(jié)構(gòu)域：N端結(jié)構(gòu)域占LONP1蛋白全長(zhǎng)的33%左右，此區(qū)域參與底物的特異性識(shí)別和結(jié)合；②ATP酶結(jié)構(gòu)域：此結(jié)構(gòu)又由兩個(gè)子結(jié)構(gòu)組成：一是較大的α/β亞結(jié)構(gòu)域，此部分是與ATP結(jié)合部位，二是α結(jié)構(gòu)域，其功能與ATP的水解有關(guān)；③P結(jié)構(gòu)域：也稱蛋白酶結(jié)構(gòu)域，此區(qū)域由150～200個(gè)氨基酸組成，是一個(gè)具有蛋白水解活性的高度保守區(qū)域[11]。

2 LONP1蛋白的功能

LONP1蛋白的高度保守性幾乎在所有的真核和原核生物中都有所體現(xiàn)[5]，其同源物在大腸桿菌、酵母菌、人線粒體內(nèi)多次被發(fā)現(xiàn)。這從一定程度上表明，LONP1蛋白的存在對(duì)于線粒體質(zhì)量的調(diào)控、維持細(xì)胞存活及生命能量供應(yīng)上有一定作用，其上調(diào)與下調(diào)牽動(dòng)著各個(gè)生命活動(dòng)的完成。有研究發(fā)現(xiàn)[12]，LONP1基因缺失的純合子（LONP1 -/-）小鼠，在胚胎時(shí)期即發(fā)生死亡；而LONP1基因雜合子（LONP1 +/-）的小鼠則可以正常生長(zhǎng)發(fā)育。

2.1 LONP1蛋白作為蛋白水解酶

LONP1蛋白功能之一是作為蛋白水解酶的水解活性，它可以降解異常或損傷的蛋白質(zhì)。氧化烏頭酸酶無法參與三羧酸循環(huán)，但它屬于LONP1蛋白的一種作用底物，可被LONP1蛋白降解[13]。輕度氧化的烏頭酸酶可被LONP1蛋白選擇性識(shí)別并降解，而過度氧化的烏頭酸酶卻不能被降解[14]。利用反義寡聚喹啉處理人肺纖維細(xì)胞后，細(xì)胞內(nèi)LONP1蛋白水平表達(dá)下降，從而導(dǎo)致了氧化的烏頭酸酶的積累[15]。

LONP1蛋白或參與類固醇激素合成的調(diào)控。類固醇激素急性合成調(diào)劑蛋白（steroidogenic acute regulatory protein，StAR）是LONP1蛋白的底物之一，參與膽固醇由線粒體外膜向基質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)，進(jìn)入基質(zhì)后的StAR蛋白被快速降解。但StAR蛋白僅在LONP1陰性突變細(xì)胞中穩(wěn)定存在，當(dāng)此類細(xì)胞中存在LONP1蛋白表達(dá)后，StAR蛋白依然會(huì)被降解[16]。

LONP1蛋白的水解活性也參與低氧狀態(tài)下環(huán)氧化酶（cyclooxygenase，COX）全酶的重新組裝。細(xì)胞色素c氧化酶亞基Ⅳ同工型1（cytochrome c oxidase subunit Ⅳ isoform 1，COX4-1）在哺乳動(dòng)物中表達(dá)廣泛；而另一亞型，即細(xì)胞色素c氧化酶亞基Ⅳ同工型2（cytochrome c oxidase subunit Ⅳ isoform 2，COX4-2）僅在如肝臟等少數(shù)組織中表達(dá)。兩亞型均受氧分壓的調(diào)節(jié)，在正常氧分壓狀態(tài)下，COX4-1在全酶中穩(wěn)定表達(dá)存在。當(dāng)細(xì)胞處于缺氧狀態(tài)時(shí)，缺氧誘導(dǎo)因子α（hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α）促進(jìn)COX4-2及LONP1的表達(dá)，LONP1的上調(diào)促進(jìn)了COX4-1的水解并加速了COX4-2組裝入全酶，進(jìn)而改變了全酶亞型的構(gòu)成比[17]。

2.2 LONP1蛋白作用于線粒體DNA

大腸桿菌的LONP1蛋白可與其DNA雙鏈結(jié)合，尤其是對(duì)富含胸腺嘧啶（thymine，T）及鳥嘌呤（guanine，G）的DNA雙鏈親和力較高。人線粒體DNA中含有與大腸桿菌LONP1結(jié)合位點(diǎn)相似的序列，這種序列在線粒體DNA重鏈和輕鏈上均存在。然而，人LONP1蛋白只選擇性的結(jié)合于單鏈線粒體DNA的特定序列上，對(duì)于其互補(bǔ)鏈無親和力[18]。LONP1蛋白不僅可參與線粒體DNA的生成過程[19]，也可通過參與線粒體轉(zhuǎn)錄因子A（mitochondrial transcription factor A，TFAM）的降解而影響DNA轉(zhuǎn)錄[20]。

LONP1蛋白不僅可與富含T、G序列的單鏈DNA結(jié)合，也可結(jié)合于T、G序列含量高的核糖核酸（ribonucleic acid，RNA）。ATP和蛋白質(zhì)底物可以調(diào)節(jié)LONP1與核酸結(jié)合的親和力，當(dāng)ATP含量豐富時(shí)，LONP與DNA或RNA的結(jié)合力下降；當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)底物含量增多時(shí)，LONP與DNA的結(jié)合力可上升約3.5倍[19]。

2.3 LONP1蛋白作為伴侶蛋白

LONP1蛋白也有分子伴侶的功能，它參與酵母菌等真菌及人線粒體內(nèi)蛋白復(fù)合體的組裝，且其作用與它的水解酶活性無關(guān)[21]。在低氧狀態(tài)下COX全酶的組裝中，LONP1蛋白被HIF-1α激活后促進(jìn)了COX4-1的水解和COX4-2在全酶內(nèi)的組裝[17]，體現(xiàn)了LONP1蛋白作為水解酶和分子伴侶的雙重性質(zhì)。線粒體熱休克蛋白70（heat shock protein 70，HSP70）對(duì)于促進(jìn)線粒體前體的折疊反應(yīng)至關(guān)重要，LONP1蛋白可與其協(xié)同，以穩(wěn)定線粒體內(nèi)膜蛋白的折疊中間體[22]。

3 LONP1蛋白與癌癥

近年來許多研究顯示，LONP1蛋白在維持腫瘤細(xì)胞存活中發(fā)揮了一定作用。首先，LONP1蛋白為腫瘤細(xì)胞在低氧狀態(tài)下創(chuàng)造生存條件。癌癥的特點(diǎn)之一為腫瘤細(xì)胞大量增殖，而這種增殖使癌細(xì)胞有兩個(gè)特點(diǎn)，一是細(xì)胞內(nèi)為低氧微環(huán)境，二是腫瘤細(xì)胞更偏向于利用糖酵解供能。在低氧狀態(tài)下，LONP1蛋白可通過COX全酶的重組來提高細(xì)胞的呼吸效率[17]。其次，LONP1蛋白作為水解酶，可以降解異常或損傷的蛋白，維持腫瘤細(xì)胞線粒體的穩(wěn)定[23]。LONP1蛋白可被蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）磷酸化，磷酸化后的LONP1蛋白水解活性增強(qiáng)[24]，有利于腫瘤細(xì)胞的存活與增殖。有許多研究表明，LONP1表達(dá)上調(diào)可影響癌細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程，促進(jìn)腫瘤的侵襲及轉(zhuǎn)移[25-27]，這個(gè)過程可經(jīng)由核因子κB（nuclear factor kappa-B，NF-κB）通路來實(shí)現(xiàn)[28]。最后，LONP1蛋白在結(jié)腸癌、膀胱癌等多種癌細(xì)胞中的高度表達(dá)也激發(fā)了人們對(duì)于LONP1與更多癌癥關(guān)系的探究，這提示一些惡性腫瘤的診斷及治療可從LONP1基因及其蛋白本身入手。

3.1 LONP1蛋白與大腸癌

目前大腸癌的發(fā)病機(jī)制尚未完全清楚，可能與癌癥發(fā)展中首先形成的息肉的基因突變有關(guān)[29]。有研究[12]在LONP1雜合子（LONP1 +/-）和LONP1純合子（LONP1 +/+）小鼠中誘導(dǎo)結(jié)腸癌形成，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，所有的LONP1純合子小鼠都罹患結(jié)腸癌，而僅有72%的雜合子小鼠罹患結(jié)腸癌。此外，在所有患有結(jié)腸癌的小鼠中，雜合子小鼠的臨床表現(xiàn)比純合子小鼠更輕。進(jìn)一步比較不同人類結(jié)腸癌細(xì)胞系以及結(jié)腸上皮細(xì)胞系中LONP1蛋白的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)LONP1蛋白在所有結(jié)腸癌細(xì)胞系中均高度表達(dá)，推測(cè)LONP1蛋白的上調(diào)促進(jìn)結(jié)腸癌的發(fā)生與發(fā)展。

Gibellini等[30]在不同來源的癌細(xì)胞中檢測(cè)了LONP1蛋白的表達(dá)程度，除結(jié)腸癌細(xì)胞之外，LONP1蛋白也在另外多種癌細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)；而在正常細(xì)胞中，LONP1蛋白處于低表達(dá)水平。沉默結(jié)腸癌細(xì)胞中的LONP1蛋白，線粒體功能下降，表現(xiàn)為線粒體DNA及TFAM的表達(dá)減少。此外，伴隨著LONP1蛋白下調(diào)，癌細(xì)胞的線粒體出現(xiàn)大小和形狀不一的情況，其內(nèi)出現(xiàn)空泡和包裹體，這均與未成熟蛋白質(zhì)的積聚有關(guān)。而在結(jié)腸癌細(xì)胞中上調(diào)LONP1蛋白表達(dá)，LONP1高表達(dá)伴隨著N-鈣黏蛋白（N-cadherin，NCAD）的表達(dá)增加和E-鈣黏蛋白（E-cadherin，ECAD）的表達(dá)降低，從而促進(jìn)了上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程。但在轉(zhuǎn)移性結(jié)腸癌細(xì)胞中上調(diào)LONP1蛋白表達(dá)，ECAD蛋白表達(dá)量增加，而NCAD蛋白表達(dá)量無明顯變化。進(jìn)一步收集大腸癌患者的癌組織標(biāo)本發(fā)現(xiàn)，在具有人體抑癌基因p53突變或核β-連環(huán)蛋白（beta-catenin，β-ctn）突變的樣品中，LONP1蛋白表達(dá)量較正常組織增多[25]。

金冬林等[31]研究了LONP1蛋白在結(jié)腸癌中的表達(dá)及其對(duì)癌癥分期和預(yù)后的影響。同先前Gibellini的研究結(jié)果相同，結(jié)腸癌組織中的LONP1蛋白表達(dá)率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于癌旁組織。在不同的癌癥分期中，LONP1蛋白的表達(dá)水平也有所差異。對(duì)術(shù)后患者隨訪，結(jié)果示高LONP1蛋白表達(dá)者的生存率和總生存期數(shù)值均小于低表達(dá)患者。

3.2 LONP1蛋白與膀胱癌

Liu等[32]測(cè)定了多種膀胱癌細(xì)胞系中LONP1蛋白的表達(dá)情況，LONP1蛋白在正常膀胱細(xì)胞中表達(dá)很低，但在癌細(xì)胞中高度表達(dá)。敲除LONP1基因，癌細(xì)胞的增殖被抑制，同時(shí)細(xì)胞內(nèi)活性氧（reactive oxygen species，ROS）生成減少、磷酸化的c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）減少。這表明LONP1蛋白或通過ROS誘導(dǎo)的絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）信號(hào)途徑下調(diào)JNK磷酸化而抑制腫瘤細(xì)胞增殖。在臨床方面，LONP1蛋白表達(dá)量與癌組織分化程度密切相關(guān)，分化程度越高的癌組織LONP1蛋白表達(dá)越低。對(duì)于患者來說，LONP1蛋白低表達(dá)者的總生存率顯著高于高表達(dá)患者。

在維持膀胱癌細(xì)胞生存的過程中，LONP1不僅可以獨(dú)自發(fā)揮作用，而且可與其他蛋白聯(lián)合，協(xié)同保護(hù)癌細(xì)胞線粒體功能。分別敲除膀胱癌細(xì)胞中的LONP1及酪蛋白水解酞酶（caseinolytic protease，ClpP）基因，癌細(xì)胞生長(zhǎng)均受到抑制。但同時(shí)敲除LONP1和ClpP基因，會(huì)比單次敲除導(dǎo)致更多的癌細(xì)胞死亡。同樣，在體內(nèi)，這兩種蛋白均高度表達(dá)的前列腺癌患者，比僅有其中一種蛋白高水平表達(dá)的患者有更短的生存期[33]。

3.3 LONP1蛋白與宮頸癌

人宮頸鱗癌細(xì)胞SiHa中的LONP1蛋白表達(dá)水平高于正常細(xì)胞。下調(diào)SiHa細(xì)胞中LONP1蛋白表達(dá)后，細(xì)胞的增殖活性、抗凋亡能力及遷徙性都有所下降，表現(xiàn)為活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3（cysteinyl aspartate specific proteinase，caspase-3）的增多及B淋巴細(xì)胞瘤-2（B-cell lymphoma-2，bcl-2）的減少[34]。

而在宮頸癌HeLa細(xì)胞中，LONP1蛋白的表達(dá)變化對(duì)于細(xì)胞的影響不明顯，蛋白表達(dá)水平變化不會(huì)引起細(xì)胞自噬和線粒體活性變化。但蛋白下調(diào)會(huì)引起HeLa細(xì)胞線粒體內(nèi)產(chǎn)更多ROS，使細(xì)胞內(nèi)氧化受損的蛋白質(zhì)增多并積累，最終抑制20 s蛋白酶體的活性[35]。

3.4 LONP1蛋白與其他腫瘤

LONP1蛋白在肝癌細(xì)胞中高度表達(dá)，其表達(dá)程度與腫瘤的臨床分期有關(guān)，分期越晚蛋白表達(dá)水平越高。在對(duì)肝癌患者的隨訪中發(fā)現(xiàn)，LONP1蛋白表達(dá)越低的患者具有越長(zhǎng)的生存期和更好的預(yù)后[36]。薛霞等[37]在人乳腺癌細(xì)胞中下調(diào)LONP1蛋白表達(dá)，癌細(xì)胞增殖被抑制，少數(shù)細(xì)胞凋亡。進(jìn)一步用紫杉醇、順鉑等藥物處理蛋白下調(diào)的癌細(xì)胞，得到同樣結(jié)果。幽門螺旋桿菌（helicobacter pylori，Hp）可反復(fù)破壞胃黏膜引起胃炎和胃潰瘍，進(jìn)而使患者罹患胃癌幾率顯著增加。在被Hp感染的胃上皮細(xì)胞中，LONP1蛋白表達(dá)增多，這種增多通過HIF-1α來直接調(diào)節(jié)[38]。

LONP1蛋白在肺成纖維細(xì)胞等正常肺組織細(xì)胞中處于低含量狀態(tài)，相反，它在肺非小細(xì)胞癌細(xì)胞中含量豐富。下調(diào)肺癌細(xì)胞中LONP1蛋白表達(dá)，發(fā)現(xiàn)活性caspase-3蛋白表達(dá)增多，并伴隨著肺癌細(xì)胞凋亡數(shù)量增多[39]。而LONP1蛋白過度表達(dá)則會(huì)使非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞對(duì)抗細(xì)胞凋亡，增加癌細(xì)胞的生存優(yōu)勢(shì)[40]。在胰腺癌中，與癌旁組織相比，LONP1蛋白在胰腺癌組織中表達(dá)上升。在胰腺癌細(xì)胞中下調(diào)LONP1蛋白表達(dá)，癌細(xì)胞的細(xì)胞增殖活力、遷徙能力及侵襲能力均受到抑制[27]。在神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞中，敲除LONP1基因后，癌細(xì)胞的活力及對(duì)缺氧的適應(yīng)能力均顯著降低。應(yīng)用LONP1抑制劑不僅可有效抑制癌細(xì)胞增殖，還可增強(qiáng)如替莫唑胺等化療藥物對(duì)神經(jīng)膠質(zhì)瘤的治療效果[41]。

4 結(jié)語與展望

綜上所述，LONP1在多種腫瘤細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，敲除或過表達(dá)LONP1基因均會(huì)影響癌細(xì)胞的增殖及遷徙。這種關(guān)系擴(kuò)展到臨床方面即表現(xiàn)為L(zhǎng)ONP1的表達(dá)量與患者預(yù)后及生存期之間的關(guān)系，現(xiàn)有研究證實(shí)，在多種腫瘤中LONP1表達(dá)量與患者生存期呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)關(guān)系。

LONP1蛋白作為存在于線粒體內(nèi)的蛋白酶，在維持線粒體穩(wěn)態(tài)方面起到重要作用，雖然眾多研究已證實(shí)LONP1蛋白在多種惡性腫瘤中高表達(dá)，但對(duì)于其作用機(jī)制缺乏深入研究。此外，LONP1的抑制劑是否可與放療或化療藥物聯(lián)合應(yīng)用提高腫瘤的治療效果也尚未明確。LONP1作為近年來腫瘤靶向治療的新熱點(diǎn)，對(duì)以上問題的繼續(xù)探討，可能對(duì)臨床上判斷腫瘤預(yù)后，進(jìn)一步增加腫瘤治療手段，并提高癌癥的治療效果提供幫助。