獲得性中耳膽脂瘤基礎研究進展

吳華東 熊園平 江紅群

南昌大學第一附屬醫院耳鼻咽喉頭頸外科(南昌330006)

獲得性中耳膽脂瘤是耳鼻咽喉科較為常見的一種慢性中耳疾病，非真性腫瘤，其角質形成細胞的異常增殖和遷移可導致鄰近組織結構的侵蝕，輕者可造成外耳、中耳結構破壞、聽力下降、面癱等并發癥；嚴重者病變可侵及內耳甚至顱內，造成如眩暈、硬膜外膿腫、腦膿腫等嚴重并發癥，甚至死亡。中耳膽脂瘤在組織學上表現為角蛋白碎片和復層鱗狀上皮的混合體,主要由3種成分構成：基質旁組織、上皮基質和含大量角蛋白碎片的囊性內容物。手術是目前獲得性膽脂瘤的唯一有效治療方法，但膽脂瘤手術后仍有復發的可能性。目前膽脂瘤的發病機制暫不明確，主流的發病機制學說有：袋狀內陷理論、上皮遷移理論、鱗狀化生理論和基底細胞增生理論。但這些理論學說尚無法完全解釋膽脂瘤的過度增殖、遷移、分化改變、侵襲性和復發性的臨床特性，因此深入了解膽脂瘤發病的分子機制和危險因素，以降低甚至解除疾病的發生、發展及復發，甚至尋找可行的非手術治療方案，成為了目前研究熱點。本文就獲得性中耳膽脂瘤相關基礎研究進展進行綜述。

1 細胞因子與獲得性膽脂瘤

獲得性膽脂瘤幾乎都存在于感染和炎癥環境中，復雜環境下產生的細胞因子對膽脂瘤的發生、發展起重要作用，研究表明膽脂瘤組織中高表達的磷酸化表皮生長因子受體（Phosphorylated epidermal growth factor receptor，pEGFR）參與了膽脂瘤的形成和發展[1，2]。Liu等人的研究發現pEGFR，磷酸化蛋白激酶B（protein kinase B，p-Akt）、細胞周期蛋白D1（cyclinD1）和增殖細胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）在膽脂瘤組織中都呈現為高表達，且p-EGFR、p-Akt、cyclinD1的表達與PCNA的表達呈顯著正相關。隨后他們建立了人外耳道角質形成細胞（External auditory canal keratinocytes，EACKs）模型，發現表皮生長因子（Epidermal growth factor，EGF）可顯著促進EACKs的增殖，且可引起CyclinD1表達的上調。而EGFR抑制劑AG1478和磷脂酰肌醇-3-激酶（Phosphatidylinositol-3-kinase，PI3K）抑制劑 Wortmannin對EGF誘導的EACKs增殖有明顯的抑制作用。由此他們推斷EGF通過激活EGFR/PI3K/Akt/CyclinD1信號通路，參與了膽脂瘤上皮的過度增殖[2]。另一項研究發現肝素結合型表皮生長因子樣生長因子（heparin-binding EGF-like growth factor，HB-EGF）相比外耳道正常皮膚組織在膽脂瘤中也呈高表達，且與膽脂瘤骨破壞程度呈正相關，提示HB-EGF可能參與了膽脂瘤上皮角質形成細胞的增殖和膽脂瘤骨破壞機制[3]，但其中的確切通路與機制仍需進一步實驗探討。

中耳膽脂瘤上皮細胞的過度增殖還與角質細胞生長因子（Keratinocyte growth factor，KGF）有關，Yamamoto-Fukuda等人通過在動物模型中耳內長期重復轉染KGF cDNA，成功誘導了中耳膽脂瘤的發生[4]。KGF還可能通過誘導pp63的表達，促進膽脂瘤干細胞和/或祖細胞的增殖活性、抑制膽脂瘤基底層祖細胞的分化，從而引起膽脂瘤上皮的增生[5]。膽脂瘤組織中的角質形成細胞還可分泌甲狀旁腺激素相關蛋白(Parathyroid hormone associated protein，PTHrP)，并通過核因子-κB受體活化因子配體（Receptor Activator of Nuclear Factor-κB Ligand，RANKL）信號通路參與中耳膽脂瘤的骨吸收過程[6]。血管生成生長因子，如成纖維細胞生長因子α（Fibroblast growth factor，FGF-α）、轉化生長因子-β（Transforming growth factor-β，TGF-β）、轉化生長因子-α（Transforming growth factor-α，TGF-α）和血管內皮生長因子（Vascular endothelial growth factor，VEGF），則與膽脂瘤基質周圍血管生成密切相關，這些細胞因子在支持角質形成細胞持續遷移到鼓室的過程中起著至關重要作用，參與膽脂瘤的擴張[7]。

此外，Mzczepanski等人發現膽脂瘤組織中胞內高表達的高遷移率族蛋白B1（high-mobility box 1，HMGB1）在應激或壞死時可從胞內釋放出來，與角質形成細胞中過度表達的晚期糖基化終產物受體（Receptor for Advanced Glycation Endproduct，RAGE）結合，導致角質形成細胞增殖、遷移和白細胞介素（Interleukin,IL）-8的分泌，參與膽脂瘤的形成和骨破壞[8]。隨后Chi等人在膽脂瘤上皮細胞外檢測到了HMGB1和凋亡膽脂瘤角質細胞釋放的DNA片段，發現當它們同時存在時可顯著誘導膽脂瘤角質形成細胞產生腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor，TNF-α）和IL-1b，導致膽脂瘤的骨吸收和破壞[9]。這些研究表明，細胞因子在膽脂瘤的生物學行為中有著重要作用，與膽脂瘤進展和骨破壞密切相關。

2 感染和獲得性膽脂瘤

獲得性膽脂瘤常常與病原體的感染相生相伴，當感染發生時與人非特異性免疫有關的病原體識別受體(Pathogen recognition receptor，PRR)可通過識別病原體表達的病原體相關分子模式,誘導一系列免疫反應的發生，從而參與膽脂瘤的發生、發展。研究發現PRR家族中Toll樣受體4（Toll-like receptors 4,TLR4）在獲得性膽脂瘤中表達增加且與疾病嚴重程度呈正相關。構建的小鼠動物模型發現，與野生型小鼠對比，缺乏TLR4表達基因的小鼠IL-1β、TNF-α、NF-κB和RANKL和抗酒石酸酸性磷酸酶（tartrate-resistant acid phosphatase，TRAP）mRNA表達水平降低，從而減少了體內破骨細胞的形成，減輕了對實驗性獲得性膽脂瘤所致的骨破壞和聽力損失[10]。與TLRs類似，髓系細胞觸發受體(triggering receptors expressed on myeloid cells，TREM)是與炎癥反應相關的受體家族，研究發現TREM-2在獲得性膽脂瘤組織中表達明顯升高，其表達水平與膽脂瘤的骨破壞程度呈正相關。而敲除小鼠的TREM-2基因可減輕實驗獲得性膽脂瘤的成熟以及膽脂瘤引起的骨破壞。這項研究認為，TREM-2可能是通過激活TLR-4信號通路放大炎癥反應、促進金屬基質蛋白酶（Matrix metallo proteinases,MMPs）的分泌以及激活膽脂瘤組織中的破骨細胞三個方面參與膽脂瘤的發生發展。然而這項研究對TREM-2激活TRL-4信號通路的證據不夠充分，仍需要更有說服力的實驗證明[11]。MMP-2和MMP-9是一組能降解細胞外基質的蛋白水解酶,研究表明MMP-2和MMP-9在膽脂瘤組織中表達明顯高于正常皮膚組織，與膽脂瘤的發生、發展及骨質破壞有關[12]。另外一項研究提示Rho激酶可能在細胞分化中起重要作用,其活性降低和表達減弱可能導致了角質形成細胞過度增殖和低分化[13]。

膽脂瘤的持續性和復發性臨床特點與膽脂瘤標本中廣泛存在細菌生物膜有關。因局部或全身應用的抗生素難以清除中耳生物膜內的固著的細菌，在某種情況下，這些生物膜內的固著細菌可重新游離，引起疾病的遷延不愈和復發。目前越來越多的證據發現生物膜廣泛存在于膽脂瘤標本中，支持了生物膜與膽脂瘤之間的聯系[14]。對膽脂瘤感染中的微生物種類研究發現，最常見的病原菌為銅綠假單胞菌[15]，Si等人將小鼠自體皮片移植入中耳腔再向中耳腔內注入銅綠假單胞菌，6周后92%的實驗動物發生了膽脂瘤[16]。誘導性膽脂瘤沙土鼠模型中，伴隨銅綠假單胞菌感染的動物與未感染組相比，前者膽脂瘤的大小和侵襲性增加[17]，這些研究都表明膽脂瘤與銅綠假單胞菌感染存在密切聯系。最近一項對膽脂瘤和正常中耳微生物區系的基因測序技術研究顯示，膽脂瘤基質和膽脂瘤附近未累及的粘膜中存在著多種微生物的感染[18]，因此獲得性膽脂瘤的發生發展可能是多種微生物感染共同導致的結果，但目前通過微生物感染種類對獲得性膽脂瘤發病機制的研究較少，仍需進一步探尋。

3 基因組學改變與獲得性膽脂瘤

與正常皮膚相比，膽脂瘤組織中有多種細胞增殖標記物表達上調，如細胞角蛋（Cytokeratin，CK）16、Ki67、PCNA等，證明了膽脂瘤上皮具有高增殖活性。Lin等人報道了中耳膽脂瘤細胞中β-鏈蛋白(β-catenin)的表達顯著增加，激活Wnt/β-catenin通路，可誘導CK16、CK18、Ki67和增殖細胞核抗原的表達，促進膽脂瘤上皮細胞增殖[19]。全基因微陣列分析發現，和正常外耳道皮膚對比，膽脂瘤中有811個基因上調，334個基因下調。多種在腫瘤中下 調 的 抑 癌 基 因 ，如 ：CDH18.19、ID4、PAX3、LAMC2、TRAF2B等在膽脂瘤中也下調。在炎癥中起重要作用的KRT6B、SPP1和S100A7A顯著上調。CK5/6、CK14以及MMPs、PAX3、SP5、TFAP2B等轉錄因子在膽脂瘤中下調[20]。另一項對膽脂瘤組織DNA差異表達分析發現，其中有104個基因表達上調，178個基因表達下調，其囊括了受體結合、細胞通訊與運動、維生素代謝、細胞因子介導炎癥等各個方面，實時PCR技術證實了其中部分關鍵基因：TCN1、PI3、IL-8、IGF-2、KLKI3、HSP90B、ARGE基因上調，而DCD、CCL27基因下調[21]。這些上調或下調的基因都可作為未來研究的重要方向。細胞型Fas相關死亡域蛋白樣白介素-1B轉換酶抑制蛋白（c-FLIP）是一種凋亡抑制蛋白，可使細胞凋亡受抑制，常常在人類惡性腫瘤和良性增生性上皮疾病中高表達，Chung等人在膽脂瘤中也發現了c-FLIP的高表達，且與細胞增殖標記物KI-67的高表達具有顯著正相關性，提示細胞凋亡和抗凋亡間的平衡性的改變在膽脂瘤的發病機制中起一定作用[22]。

總而言之，對獲得性膽脂瘤基因組的研究表明有許多分子調節網絡參與了疾病的發生，這些調節節點在未來可能成為藥物治療的靶點。

4 micro-RNA與獲得性膽脂瘤

micro-RNA是一種長度約20-24個核苷酸的非編碼單鏈RNA分子，在控制細胞功能，包括細胞分化、增殖和凋亡方面發揮重要作用。Zang等人發現miR-203a在膽脂瘤組織中表達下調，其下調導致了其直接靶基因轉錄因子Bmil的上調，Bmi1可促進角質形成細胞的增殖，防止膽脂瘤細胞過早衰老和死亡，此外，Bmi1還可增強p-Akt的表達，通過這兩種作用機制從而促進了膽脂瘤上皮細胞的生長、增殖[23]。MiR-21因在多種癌癥組織中高表達而廣為人知，其可通過抑制抑癌基因的表達而導致細胞的異常增殖，常被認為是一種致癌miRNA；let-7miRNA在許多實體器官腫瘤中表達下調，并通過靶向癌基因發揮腫瘤抑制作用。Chen和Qin等人發現膽脂瘤組織中的miR-21和let-7amiRNA的表達水平明顯高于正常皮膚，且這種現象在兒童膽脂瘤中尤為明顯，他們的研究認為膽脂瘤中高表達的let-7miRNA可能通過抑制HMGA2的表達，導致角質形成細胞凋亡增加和膽脂瘤細胞增殖減少，miR-21的上調則導致了膽脂瘤的高增殖和侵襲性特點，因此膽脂瘤的高增值但卻表現為良性的性質是由于let-7a microRNA和miR-21之間的動態平衡所致，但這一點仍有待完全確定[24]。隨后Zhang等人發現let-7a模擬物的過表達抑制了miR-21的表達。相反，抑制let-7a可促進miR-21的表達。證實了microRNA let-7a可通過使角質形成細胞周期阻滯于G0/G1期從而抑制其增殖和誘導其凋亡兩種機制抑制膽脂瘤的生長，且let-7a還可抑制膽脂瘤角質形成細胞的遷移和侵襲[25]。在隨后的研究中他們進一步發現抑制miR-21也可促進let-7a miRNAs的表達，表明miR-21和let-7a miRNAs之間還存在除下游靶點以外的相互調節機制[26]。最近Xie等人利用miRNA微陣列技術比較了獲得性中耳膽脂瘤和正常皮膚的miRNA表達譜[27]，發現膽脂瘤組織中共有44個上調的miRNA(miRNA-21-3p、miRNA-584-5p、miRNA-16-1-3p等)和175個下調的 miRNA(miRNA-10a-5p、miRNA-152-5p、miRNA-203b-5p等)。血管生成在膽脂瘤的擴張中作用也必不可少[6]，在人膽脂瘤周圍成纖維細胞分泌的外泌體中，miR-106b-5p表達的下調，對鄰近內皮細胞中血管緊張素II的抑制作用減弱，以此促進膽脂瘤新生血管形成，從而調節膽脂瘤的發展[28]。

5 獲得性膽脂瘤中的干細胞

Nagel等人首次報道了在膽脂瘤組織中發現干細胞群體：中耳膽脂瘤干細胞（Middle Ear Cholesteatoma derived Stem Cells,ME-CSC）。它們具有自我更新、形成神經球和分化為中胚層和外胚層細胞型的能力。相比健康外耳道皮膚來源的干細胞，ME-CSC具有更高的TLR4表達和對炎癥刺激的敏感性。將其置于模擬膽脂瘤的微環境中還能夠分化為角質形成細胞樣細胞。隨后，進一步對比MECSC和外耳道皮膚干細胞，發現ME-CSC的TLR4的表達顯著增加的同時，伴隨著TNF-α，IL-1α，IL-1?，IL-6和IL-8的脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）依賴性促炎基因表達顯著增強。與TNFα處理的外耳道皮膚干細胞相比，用TNFα刺激ME-CSC導致IL-6，IL-8以及TNFα本身的表達水平顯著提高。他們認為這是由于ME-CSCs中存在一個由TNF-α驅動NF-κB從而激活的放大炎癥的正反饋循環[29]。進一步實驗中發現TLR4拮抗劑LPS-RS可使MECSC的IL-1?，IL-6和TNFα表達幾乎完全喪失，從而阻斷ME-CSCs對炎癥的放大反應[30]。這些發現表明了膽脂瘤干細胞的存在及在膽脂瘤中的作用，為膽脂瘤的臨床治療提供了可能的干預方向。

6 結論與展望

本文對獲得性膽脂瘤的基礎研究進行了較為全面的總結和綜述，但其具體發病機制仍需進一步研究和闡明，目前對膽脂瘤的基礎研究更進一步提示了炎癥介質、局部感染、基因組學改變和膽脂瘤干細胞與膽脂瘤的生物學行為密切相關。這些研究結果，為我們后續膽脂瘤的干預和治療提供了理論基礎。