鼻腔鼻竇內翻性乳頭狀瘤組織中E盒結合鋅指蛋白2的表達及其與臨床病理特征的關系▲

石書婧 徐 莉 翟建華 胡小兵 喬振花 劉 曼 范志濤 王建國

(河北省眼科醫院耳鼻咽喉-頭頸外科，邢臺市 054000，電子郵箱：shishujing163@163.com)

鼻腔鼻竇內翻性乳頭狀瘤(sinonasal inverted papilloma，SNIP)是臨床上常見的良性腫瘤，其發病率位居鼻腔鼻竇良性腫瘤的首位，具有侵襲性生長、易復發等與惡性腫瘤相似的特點[1]。E盒結合鋅指蛋白(zinc finger E-box-binding homeobox，ZEB)2為ZEB家族中的一員，參與鼻咽癌、口腔鱗狀細胞癌等多種腫瘤的發生和發展過程[2]。但關于ZEB2在SNIP組織中表達的情況及其與SNIP發生和發展關系的研究較少。本研究檢測了SNIP組織中ZEB2的表達，并分析其與SNIP發生和發展的關系，旨在為SNIP的診斷、治療和改善患者預后提供參考。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 納入2016年1月至2018年1月我院收治的51例SNIP患者(病例組)，收集其SNIP組織；另納入20例同期在我院接受鼻中隔偏曲矯正術的鼻竇炎患者(對照組)，收集其增生鼻甲組織。所有病例均經病理組織學確診，所獲標本均保存于-80℃環境；相關臨床資料記錄完整，包括年齡、性別、臨床分期、復發情況、病理分化程度。SNIP組中男性31例、女性20例，年齡23～71歲(中位年齡46歲)；對照組中男性11例、女性9例，年齡22～70歲(中位年齡42.5歲)。兩組性別、年齡差異無統計學意義(均P>0.05)。

1.2 主要試劑和儀器 TRIzol試劑(上海Ambion生物科技有限公司，生產批號：50175111)、反轉錄試劑盒(美國Thermo 公司，批號：00820439)、PCR反應試劑盒為FastStart Universal SYBR Green Master(Rox)(瑞士Roche公司，批號：21966100)；7300型熒光定量PCR儀(美國ABI公司)，超微量分光光度計(美國Thermo公司)。

1.3 總RNA提取和反轉錄 取50 mg組織標本，放入1.5 mL EP管內并置于冰上，加入600 μL預冷(4℃)TRIzol試劑，用眼科剪將組織剪至勻漿狀態已充分裂解后，嚴格按照TRIzol試劑說明書抽提組織中的總RNA；獲得組織中的總RNA后，取2 μL，使用超微量分光光度計測定總RNA的質量及濃度，以A260/280處于1.8～2.0為宜。取2 μg總RNA，使用RNA反轉錄試劑盒將其反轉錄為cDNA；反應體系：2 μg總RNA、1μL Oligo(dT)18引物、4 μL 5×反應緩沖液、1μL RiboLock RNase抑制劑(20 U/μL)、2 μL 10 mM dDTP混合液、1 μL RevertAid M-MuLV反轉錄酶(200 U/μL)，加入無核酶水至反應體積為20 μL；反應程序：42℃ 60 min，70℃ 5 min。

1.4 檢測ZEB2 mRNA的表達量 以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)作為內參。采用PCR反應試劑盒擴增ZEB2基因。反應體系：SYBR GreenⅠ10 μL，cDNA 1 μL，上游引物1 μL，下游引物1 μL，雙蒸水7 μL。反應條件：95℃預變性10 min；95℃ 變性 15 s，60℃ 退火 30 s，共40個循環。引物序列由廣州Invitrogen公司合成，GAPDH上游引物為5′-GACAACTTTGGCATCGTGGA-3′，下游引物為5′-ATGCAGGGATGATGTTCTGG-3′；ZEB2 上游引物為5′-AGTCCTCCCCACACGTGAG-3′，下游引物為5′-TGCGGTCTGGATCGTGGCTTC-3′。反應完成后，記錄各樣本的Ct值，采用2-△△ct法計算基因的相對表達量。先計算病例組或對照組的△Ct，△Ct =CtZEB2-CtGAPDH；再計算出對照組△Ct的均值△Ct′，分別計算出兩組相對于△Ct′的△△Ct，△△Ct病例組=△Ct病例組-△Ct′，△△Ct對照組=△Ct對照組-△Ct′；最后采用2-△△ct公式計算出兩組ZEB2的相對表達量[3]。

1.5 統計學分析 采用SPSS 16.0軟件對數據進行統計。計量資料以M(P25，P75)表示，組間比較采用秩和檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 兩組ZEB2基因的表達水平比較 病例組ZEB2基因的相對表達水平為1.199(0.726，2.993)，對照組ZEB2基因的相對表達水平為1.000(0.607，1.315)。病例組ZEB2基因的相對表達水平高于對照組(z=-1.969，P=0.049)。

2.2 病例組患者ZEB2基因表達水平與臨床病理參數的關系 不同性別、年齡、臨床分期以及有無復發患者之間ZEB2 mRNA相對表達水平比較，差異均無統計學意義(均P>0.05)。伴惡變患者的ZEB2 mRNA相對表達水平均高于無不典型增生及伴不典型增生患者(P<0.05)，而伴不典型增生患者與無不典型增生患者ZEB2 mRNA相對表達水平比較，差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 不同臨床病理特征病例組患者ZEB2 mRNA相對表達水平比較[M(P25，P75)]

3 討 論

SNIP是一種源于鼻腔、鼻竇施耐德氏上皮細胞的良性腫瘤，占所有鼻腔腫瘤的0.5%～4%；盡管SNIP是一種組織學良性病變，但其具有侵襲性生長、局部破壞性較強、易復發和惡性轉化等特點[4]。通常認為人類乳頭瘤病毒感染參與了SNIP的進展，其他可能的病因還包括長期炎癥刺激、上皮化生、變態反應以及種族因素等[5]。然而，SNIP的惡性轉化過程涉及的組織形態學、免疫組織化學過程和生物標志物等仍不清楚。因此，探索SNIP惡性轉化的分子機制十分重要。

腫瘤的發生、發展、侵襲和轉移是一個多基因、多層次、多步驟的復雜調控過程。研究表明，上皮間質轉化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)在腫瘤侵襲、組織穩態和纖維化等方面發揮著重要作用。EMT促進腫瘤發生、侵襲及轉移的機制為：EMT可降低腫瘤細胞間黏附力，增強其運動遷移能力，使腫瘤細胞更易脫離原發灶進入循環系統而引起遠處轉移[6]。EMT與ZEB2的關系密切，ZEB2的高表達與EMT、多種腫瘤的發生和發展相關。研究表明，ZEB2可通過抑制E-鈣粘連蛋白并誘導EMT來促進腫瘤細胞的侵襲和轉移[7]。Zhao等[8]的研究表明，Src通過蛋白激酶信號通路上調ZEB1和ZEB2水平，促進胃癌細胞的EMT和遷移，這提示ZEB1和ZEB2的上調與胃癌的EMT和遷移有關。易翔等[9]的研究表明，在鼻咽癌組織中ZEB2的表達升高而E-鈣粘連蛋白的表達下降，兩者的表達呈明顯負相關，且共同參與了鼻咽癌的轉移過程，其可能機制與ZEB2下調E-鈣粘連蛋白的表達促進細胞EMT有關。Pan等[10]發現，雙微體2癌基因結合蛋白可通過上調ZEB2表達以誘導EMT過程，從而促進非小細胞肺癌的侵襲。本研究結果顯示，SNIP組織ZEB2基因表達水平高于對照組組織，且伴惡變的SNIP組織ZEB2基因表達水平高于有或無不典型增生的SNIP組織(P<0.05)，即SNIP的病理分期越高，ZEB2基因表達水平也越高，這說明ZEB2基因的高表達不僅可能參與了SNIP的發生，還可能與其病理分期密切相關，或許能夠影響疾病的預后。結合以上研究，我們認為ZEB2在SNIP的發展、惡變演變過程中起到一定作用，可反映SNIP侵襲惡變的生物學行為。

綜上所述，SNIP組織中ZEB2的表達升高，其表達水平可能與病理分化程度有關。ZEB2可能與SNIP的發生及惡變以及增殖、侵襲相關，或可作為SNIP的生物標志物。檢測SNIP組織中ZEB2的表達，或有利于指導臨床的診斷、治療和改善預后。SNIP的復發率較高，但本研究未顯示ZEB2的表達與SNIP的復發相關，考慮與本研究的樣本量較少有關，今后需進一步擴大樣本量進行研究。