基于網絡藥理學探討麻黃湯治療新型冠狀病毒肺炎所致發熱的分子機制▲

唐秀松 方 剛 羅 俊 黃 安 陳秋霞 陳 靜

(廣西中醫藥大學壯瑤藥工程技術研究中心， 南寧市 530200，電子郵箱：1145330495@qq.com)

2019年12月底新型冠狀病毒肺炎疫情的爆發，對我國人民生命健康造成嚴重危害，該病具有傳播速度快、傳染性強、人群普遍易感的特征，臨床多表現為發熱、干咳、乏力，嚴重者可出現呼吸窘迫，多臟器功能衰竭甚至死亡[1-4]。中醫認為，新型冠狀病毒肺炎屬于“溫疫”范疇，其病因病機為濕飲停聚，外加風熱疫毒，肝木乘克脾土，脾虛運化無權，濕邪內生所致；病位在三焦或膜原，侵犯脾肺，可累及心、肝、腎、大腸；治療上主張以內清熱、外涼解法治之[5-6]。中醫中藥在新型冠狀病毒肺炎的治療上發揮了極為關鍵的作用，包括臨床上常見的清肺排毒湯、連花清瘟顆粒、化濕敗毒湯、疏風解毒膠囊等，并且治療效果明顯，且不少中藥方劑或中成藥被納入了新型冠狀病毒肺炎診療方案[7]。然而，很多中藥發揮治療作用的藥理機制卻尚未明確。

麻黃湯出自張仲景的《傷寒論》，是經典名方之一，具有發汗解表、宣肺平喘之功效[8]。在此次疫情中，以麻黃湯為基礎方加減組成的方劑也發揮了很重要的作用，經典的清肺排毒湯即包含了麻黃、桂枝、炙甘草、炒苦杏仁四味藥物，在張治國的“藥人”學說中，麻黃湯也被推薦作為治療體格粗壯、皮膚較粗糙且干燥型的新型冠狀病毒肺炎患者的處方之一[9]。網絡藥理學是構建藥物與疾病之間“成分-靶點-通路-疾病”網絡關系，并能將其作用機制進行可視化的一種高效方法，它是一種基于系統生物學來從整體的角度綜合分析藥物對疾病網絡的干預與影響的一門學科[10]。網絡藥理學能夠有效預測藥物功能或特定功能所對應的藥物，是目前中藥藥效物質基礎研究的重要手段之一[11]。因此，本研究借助網絡藥理學方法，對麻黃湯緩解新型冠狀病毒肺炎所致發熱的分子機制進行研究，以期為麻黃湯的臨床進一步應用提供理論依據及用藥選擇。

1 資料與方法

1.1 麻黃湯有效活性成分與相關靶點的篩選 分別以麻黃湯中各個藥物的名稱(麻黃、桂枝、苦杏仁、甘草)為關鍵詞，在中藥系統藥理學數據庫和分析平臺(http://ibts.hkbu.edu.hk/lsp/tcmsp.php)中進行檢索，按照生物利用度≥30%、類藥性≥0.18進行有效成分篩選[12]。在中藥系統藥理學數據庫和分析平臺的“Related Targets”欄目中收集麻黃湯有效活性成分的相關靶點(藥物靶點)；再在UniProt數據庫(https://www.uniprot.org/)中，利用Perl腳本對藥物靶點進行基因注釋后獲取其對應的人類基因，去除重復項后得到麻黃湯藥效成分調控的靶點。

1.2 疾病靶點基因收集 在OMIM數據庫(http://omim.org/)和GeneCards數據庫(https://www.genecards.org)中輸入關鍵詞“fever”，搜索與發熱相關的疾病靶點[13]，去除重復靶點后得到疾病相關靶點。運用Venny平臺(版本2.1,http://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/)將麻黃湯藥效成分調控的靶點與發熱的治療靶點取交集，得到麻黃湯治療發熱的靶點基因，即藥物-疾病交集的靶點基因(共194個)。

1.3 PPI網絡構建及關鍵基因可視化 在STRING數據庫(https://string-db.org)中導入194個藥物-疾病交集的靶點基因，選擇檢測物種為人(Homo sapiens)，去除離散或無關聯的基因節點，取medium confidence值=0.04為篩選標準，最終得出相應蛋白-蛋白相互作用(protein-protein interaction,PPI)網絡圖。按照基因Count值由大到小排序，選取前30個基因作為關鍵基因，運用R×64 3.6.1軟件中的count.R程序包對PPI網絡中的關鍵基因進行可視化，繪制樹狀圖。

1.4 靶點基因功能富集分析及通路富集分析 將所得194個交集基因導入R×64 3.6.1軟件，進行基因本體(Gene Ontology，GO)分類富集分析和京都基因與基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG) 通路分析，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 麻黃湯有效活性成分與相關靶點 麻黃湯中的有效活性成分共141個，主要包括槲皮素、豆甾醇、β-谷固醇、木犀草素、(+)-兒茶素、柚皮苷、沒食子酸、甘草糖苷E、香豆素A等；獲得潛在相關靶點數9 770個，去除重復項后結果得到麻黃湯對應的人類基因靶點222個。見表1。

表1 麻黃湯的活性成分、有效活性成分、潛在相關靶點數(n)

2.2 麻黃湯治療發熱的靶點基因 去除重復靶點后得到疾病相關靶點7 073個。運用Venny平臺取交集后得到麻黃湯治療發熱的靶點基因共194個，見圖1。

圖1 麻黃湯與新型冠狀病毒肺炎所致發熱的交集靶點

2.3 PPI網絡及關鍵基因可視化結果 所構建的PPI網絡中有194個節點，3 642條邊，平均每個節點的度為37.5，平均局部聚類系數為0.593，PPI富集程度(P值)為<1016，見圖2。同時運用R×64 3.6.1軟件對網絡中的30個關鍵基因進行可視化，繪制樹狀圖，見圖3。

圖2 麻黃湯治療新型冠狀病毒肺炎所致發熱的PPI網絡

圖3 PPI網絡中的核心靶點蛋白

2.4 交集靶點基因的GO富集分析及KEGG通路富集分析 GO分析共得到170個主要生物過程，主要涉及DNA結合轉錄激活劑活性、RNA聚合酶Ⅱ特異性、細胞因子受體結合、細胞因子活性、泛素樣蛋白連接酶結合、核受體活性等，見表2；KEGG通路富集分析結果顯示其主要涉及胞內磷脂酰肌醇激酶(phosphatidylinositol 3-kinase,PI3K)-蛋白激酶B(protein kinase B,Akt)信號通路、低氧誘導因子1(hypoxia inducible factor 1,HIF-1)信號通路、核因子κB(nuclear factor kappaB,NF-κB)信號通路、環磷酸鳥苷(cyclic guanosine monophosphate，cGMP)-蛋白激酶G(protein kinase G,PKG)信號通路等46個信號通路，見表3。

表2 GO功能富集分析結果(前20個生物過程)

表3 KEGG信號通路富集分析結果(前20個通路)

3 討 論

麻黃湯為經典方劑之一，其具有很強的代表性，其組方精練，功效顯著，是臨床治療外感病的基礎方劑[14]。柯琴在《傷寒來蘇集》中的“傷寒附翼”卷上對麻黃湯做出了較高的評價：“此湯入胃，行氣于玄府，輸精于皮毛，斯毛脈合精而溱溱汗出，在表之邪，其盡去而不留，痛止喘平，寒熱頓解，不煩啜粥而籍汗于谷也”[15]。現代藥理研究表明，麻黃湯的有效組分不僅可抑制發熱大鼠致熱因子白細胞介素(interleukin,IL)-6、IL-1β、腫瘤壞死因子α的釋放，還可降低體溫升高幅度，此外麻黃湯飲片湯劑同時還具有止咳、抗炎的效果[16-17]。

本研究通過網絡藥理學的方法分析麻黃湯治療新型冠狀病毒肺炎所致發熱的作用機制，結果顯示，麻黃湯有效活性成分共141個，相關預測潛在靶點9 770個，與新型冠狀病毒肺炎所致發熱共有靶點194個，篩選出30個關鍵基因，GO基因富集分析得到主要生物過程170個，KEGG通路分析得到信號通路46條，這說明麻黃湯具有通過多成分、多靶點、多通路來緩解新型冠狀病毒肺炎所致發熱的作用。

本研究中，PPI網絡中的前30個關鍵核心靶點蛋白包括STAT3、AKT1、JUN、MAPK1、IL-6、CXCL2、VEGFA、IL-1B等，大多數是與誘導炎癥發生發展有關的蛋白。而新型冠狀病毒肺炎是一種由病毒感染而引起機體產生一系列炎癥反應的過程，并且炎癥的加重與細胞因子風暴息息相關[18]。本研究結果還顯示，麻黃湯的主要有效活性成分包括槲皮素、豆甾醇、β-谷固醇、木犀草素、(+)-兒茶素、柚皮苷、沒食子酸、甘草糖苷E、香豆素A等。而槲皮素不僅具有抗氧化、抗炎作用，而且能作用于信號通路相關蛋白，如PI3K-Akt通路、酪氨酸激酶等，同時槲皮素可與新型冠狀病毒3CL水解酶結合而發揮抗病毒作用[19-20]。此外，豆甾醇[21]、木犀草素[22]、β-谷固醇[23]、(+)-兒茶素[24]、柚皮苷[25]、沒食子酸[26]等均具有抗炎、抗菌、抗氧化等作用。

本研究GO生物過程功能富集結果顯示，麻黃湯緩解新型冠狀病毒肺炎所致發熱的生物過程主要集中于酶活性、受體激活、因子結合等方面，KEGG通路富集結果顯示其作用途徑主要有PI3K-Akt信號通路、HIF-1信號通路、NF-κB信號通路、cGMP-PKG信號通路等。其中，PI3K-Akt信號通路是一種重要的細胞內信號轉導通路，其對細胞功能具有重要影響，此通路的異常激活導致抗凋亡基因高表達，與炎癥發生發展密切相關[27]。HIF-1信號通路可能通過調節有關基因的表達來影響細胞凋亡等，進而維持全身細胞、組織的氧穩定并使它們耐受低氧狀態，以減少缺氧對全身細胞、組織帶來的損害[28]。在膿毒癥發病過程中，NF-κB信號通路具有重要介導作用，其正反饋調節可增強促炎因子基因的轉錄，其負反饋調節則能抑制促炎因子的表達，當正負反饋調節失衡時就會引起嚴重的炎癥反應,甚至是膿毒癥,最終導致多功能障礙綜合征[29]。cGMP-PKG信號通路則與組織缺血/再灌注損傷有關，研究表明，一氧化氮-環磷酸鳥苷酸-蛋白激酶G信號通路與低氧誘導的細胞免疫逃避密切相關,可抑制或激活該信號通路而增強或抑制細胞的免疫逃避[30-31]。

綜上所述，麻黃湯緩解新型冠狀病毒肺炎所致發熱的機制是多靶點、多個生物過程、多途徑來共同參與的，其可能是通過抑制炎癥反應、減弱病毒活性、保護組織等來緩解細胞因子風暴，從而發揮緩解癥狀的作用。在實際臨床運用中尚需謹守病機，隨證施治，為中醫藥更好地發揮抗擊疫情作用貢獻中醫的智慧和力量。