宮頸癌患者癌組織中CD49f的表達量及其對免疫指標水平和不良生存結局的影響

任曉紅 楊文婷 鄭鵬生,3

(西安交通大學第一附屬醫院1 醫學部，2 生殖醫學科，陜西省西安市 710061，電子郵箱：xianrenxiaoh@163.com；3 西安交通大學醫學部環境與疾病相關基因教育部重點實驗室,陜西省西安市 710061)

了解腫瘤異質性如何介導人類癌癥的進展，是癌癥生物學的一個持續性挑戰[1]，特別是關于上皮細胞-間充質轉化(epithelial to mesenchymal transition，EMT)與化學抗性的關聯，以及腫瘤異質性的階段特異性作用，均是目前很難理解的現象。對于人宮頸癌細胞中已被鑒定出來的特定亞組包括CD49f (+)細胞，一些研究者已經建議將其作為腫瘤起始細胞[2-3]。CD49f可在正常宮頸基底層表達，甚至可存在于宮頸上皮內瘤變的宮頸上皮的上層[3]。CD49f已被證明與腫瘤的侵襲性有關，是一種可能導致集體侵襲的基底細胞的標志物[4-5]。本研究分析宮頸癌患者癌組織CD49f的表達情況，以及其對免疫指標、生存結局的影響，以期為宮頸癌的臨床診療提供參考。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 納入2013年1～12月西安交通大學第一附屬醫院收治的50例宮頸癌患者作為宮頸癌組。納入標準：(1)宮頸癌診斷符合《宮頸癌診斷與治療指南(第四版)》[6]的診斷標準；(2)年齡40～50周歲；(3)入組前未接受其他治療；(4)簽署知情同意書。排除標準：(1)有其他惡性腫瘤病史；(2)合并其他重大影響生存疾病的患者。50例宮頸癌患者中，按照國際婦產科聯盟(International Federation of Gynecology and Obstetrics,FIGO)標準分期，其中Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期、Ⅳ期各9(18.0%)、18(36.0%)、17(34.0%)、6(12.0%)；鱗癌、腺癌、腺鱗癌各32(64.00%)、17(34.00%)、1(2.00%)；中、高分化為32例(64.00%)，低分化18例(36.00%)；腫瘤直徑<3 cm共21例(42.00%)，≥3 cm共29例(58.00%)；盆腔淋巴結轉移16例(32.00%)；HPV分型16/18雙陽性共29例(58.00%)。并選擇50例因各種宮頸良性病變行宮頸活檢術的患者作為對照組。兩組患者的年齡、身高、體重以及吸煙史、飲酒史比較，差異均無統計學意義(均P>0.05)，見表1。本研究經我院倫理委員會批準，所有研究對象均知情同意。

表1 兩組患者一般資料的比較

1.2 宮頸癌治療方法 參照《宮頸癌診斷與治療指南(第四版)》[6]，根據宮頸癌患者的分期，采取手術+放療的方法進行治療。

1.3 免疫組化法檢測組織中CD49f蛋白的表達 收集研究對象手術切除的宮頸病變組織，經10%甲醛固定，常規石蠟包埋，4 μm連續切片，烤箱65℃烤片4 h。然后采用二甲苯脫蠟，乙醇脫水，高pH抗原修復液修復抗原。自然冷卻后，取出切片，磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffered saline,PBS)沖洗3次，3%過氧化氫封閉20 min，PBS沖洗3次。將羊血清與PBS充分混勻后，滴于切片上。將CD49f抗體(Thermo Fisher公司，批號：710209；比例為1 ∶500)滴加在切片上，置于4℃過夜。滴加生物素標記的二抗(北京中山生物技術有限公司，批號：07051521；比例為1 ∶200)，PBS沖洗，二氨基聯苯胺顯色，乙醇脫水，二甲苯透明。免疫組化染色陽性反應為黃-棕褐色顆粒，首先在低倍鏡下(100×)觀察選擇有代表性的區域，然后在高倍鏡下(400×)計數 500～1 000個腫瘤細胞；采用半定量積分法判斷結果：陽性細胞數<5%為0分，6%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，>75%為4分；陽性強度以多數細胞的陽性著色程度為準，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。以上述兩個積分相乘為最終得分，0～5分為陰性(-)，6～12 分為陽性(+)[7]。

1.4 實時熒光定量PCR 檢測組織中CD49f mRNA的表達 取手術切除宮頸病變組織，采用總RNA抽提試劑盒(北京艾德萊生物科技有限公司，批號：252250AX)提取RNA，采用反轉錄試劑盒(美國GeneCopoeia公司，批號：CO2011A)將RNA反轉錄生成cDNA。以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)為內參，GAPDH正向引物為5′-GGCATGGACTGTGGTCATGAG-3′，反向引物為5′-TGCACCACCAACTGTTAGC-3′；CD49f正向引物為5′-ATGCACGCGGATCGAGTTT-3′ ，反向引物為 5′-TTCCTGCTTCGTATTAACATGCT-3′。引物由金斯瑞公司合成，SYBER Green Master Mix試劑購自美國Invitrogen公司(批號：4367659)。配置PCR反應體系(上游引物0.6 μL，下游引物0.6 μL，SYBER Green Master Mix 10 μL，cDNA 3 μL及無核酸酶水5.8 μL)，混勻后進行PCR擴增，反應條件具體如下：95℃預變性5 min；95℃變性15 s ，60℃復性及延伸30 s ，40個循環。基因相對表達量采用2-ΔΔCt法[8]計算。

1.5 免疫指標的檢測 開始治療前取兩組患者全血5 mL，各分為兩管，待用于檢測免疫指標，主要包括血清免疫抑制酸性蛋白(immunosuppressive acidic protein，IAP)、T淋巴細胞亞群(包括CD3+、CD4+、CD8+T淋巴細胞)、自然殺傷細胞(CD16+CD56+)。其中一管采用無菌肝素抗凝，置于-80℃保存，用貝克曼庫爾特商貿(中國)有限公司CytoFLEX LX型流式細胞儀檢測T淋巴細胞亞群和自然殺傷細胞；另一管在1 h內以2 000 r/min離心20 min分離血清并置于-80℃保存，用酶聯免疫吸附法測定血清IAP；IAP試劑盒由杭州江萊檢測中心提供(批號：JL12703)，按照說明書進行操作。

1.6 隨訪 隨訪起始時間為患者治療第1天，終止時間為2019年1月1日；終點事件為死亡。通過查閱宮頸癌患者的病歷資料、電話詢問、門診隨訪等方式隨訪，隨訪內容主要為患者目前生存狀態及返院復查情況等。失訪的患者按照最后一次隨訪時間來計算。

1.7 統計學分析 采用SPSS 20.0軟件進行統計分析。計數資料以例數(%)表示，組間比較采用χ2檢驗；計量資料以(x±s)表示，組間比較采用t或t′檢驗；采用Pearson相關系數分析CD49f mRNA表達水平與免疫指標表達水平的相關性；采用Cox模型分析影響宮頸癌患者生存的相關因素。以P<0.05為差異具有統計學意義。

2 結 果

2.1 兩組宮頸組織中CD49f的表達水平的比較 宮頸癌組、對照組的CD49f蛋白陽性率分別為42.0%(21/50)和12.0%(6/50)，CD49f mRNA的相對表達量分別為0.32±0.16、0.24±0.08；宮頸癌組的CD49f蛋白陽性率及CD49f mRNA相對表達量均高于對照組(χ2=11.416，P<0.001；t=3.162，P=0.002)。見圖1。

圖1 CD49f蛋白在對照組和宮頸癌組中的表達(免疫組織化學染色，400×)

2.2 兩組血清免疫指標水平的比較 與對照組比較，宮頸癌組血清CD3+T淋巴細胞、CD4+T淋巴細胞水平以及CD4+/CD8+比值降低，CD8+T淋巴細胞、自然殺傷細胞以及IAP水平上升(均P<0.05)。見表2。

2.3 宮頸癌患者癌組織中CD49f mRNA相對表達量與血清免疫指標水平的相關性 宮頸癌患者的癌組織CD49f mRNA相對表達量與血清IAP水平、CD8+T淋巴細胞水平、自然殺傷細胞水平呈正相關(r=0.660，P=0.037；r=0.505，P=0.022；r=0.480，P=0.040)，與CD3+T淋巴細胞和CD4+T淋巴細胞水平均呈負相關(r=-0.451，P=0.044；r=-0.526，P=0.019)。

表2 兩組血清免疫指標水平的比較(x±s)

2.4 宮頸癌患者生存情況的影響因素

2.4.1 隨訪結果：隨訪12～187個月，中位隨訪時間20個月，隨訪期間死亡1例(腺鱗癌)。

2.4.2 單因素分析：以年齡、身高、體重、吸煙及飲酒情況、家族史、病理參數及CD49f mRNA表達量作為自變量，引入Cox模型進行單因素分析，變量賦值見表4。結果顯示，腫瘤直徑、FIGO分期、腫瘤的分化程度、淋巴結轉移、CD49f mRNA相對表達量均是宮頸癌患者生存的影響因素(均P<0.05)。見表4。

表3 變量賦值

表4Cox單因素分析

變量b值SE值Wald χ2值P值RR值(95%CI)年齡0.0240.2840.0070.9331.024(0.587,1.786)身高0.1460.2400.3700.5431.157(0.723,1.852)體重0.2800.1952.0510.1521.323(0.902,1.940)吸煙0.7190.4892.1610.1422.052(0.787,5.350)飲酒0.2050.2920.4950.4821.228(0.693,2.176)有家族史0.6600.4072.6270.1051.934(0.871,4.294)腫瘤分化程度-1.044 0.12866.741<0.001 0.352(0.274,0.452)病理類型0.3290.2012.6620.1031.389(0.936,2.061)腫瘤直徑0.2290.03542.014<0.001 1.257(1.173,1.347)淋巴結轉移 0.8320.2709.5040.0022.298(1.354,3.900)FIGO分期1.1030.23621.813<0.001 3.014(1.897,4.789)CD49f mRNA相對表達量0.5660.07655.480<0.001 1.762(1.518,2.045)

2.4.3 多因素分析：將單因素分析中有統計學意義的變量引入Cox模型進行多因素分析；結果顯示，腫瘤分化程度、腫瘤直徑、FIGO分期、CD49f mRNA相對表達量均是宮頸癌患者生存的獨立影響因素(均P<0.05)。見表5。

表5Cox多因素分析

變量b值SE值Wald χ2值P值RR值(95% CI)腫瘤分化程度-0.448 0.1558.397 0.0040.639(0.472,0.865)腫瘤直徑0.2740.05029.870<0.0011.315(1.192,1.451)CD49f mRNA相對表達量0.4660.1776.948 0.0081.594(1.127,2.254)FIGO分期0.6030.14816.720<0.0011.828(1.369,2.441)

3 討 論

整合素α6亞單位又稱為CD49f，是已知在干細胞群體和體細胞如角質形成細胞、血小板、上皮細胞和角膜基底細胞中被鑒定出來的蛋白質[9-10]。自該整合素家族的亞基在1998年首次被鑒定出來后，已在超過30種干細胞群中發現存在CD49f的表達，其中包括多功能干細胞以及腫瘤干細胞[11]。

大多數腫瘤內的不同細胞群具有自我更新和分化成新腫瘤細胞的潛力，因此被稱為腫瘤起始細胞或腫瘤干細胞。在膠質母細胞瘤腫瘤干細胞中，CD49f被認為是自我更新、增殖和腫瘤形成能力的重要調節因子[12]。在宮頸癌細胞中，CD49f主要來自4個不同的腫瘤干細胞群：HeLa、SiHa、Ca Ski、C-4-I。與單層培養的親代細胞系相比，從球狀體獲得的CD49f顯示出了自我更新的特性，這一特性增強了其致癌能力以及對電離輻射的抗性[13-14]。當患者免疫力低下時，CD49f則更加容易表達[15]。本研究結果顯示，宮頸癌組癌組織的CD49f蛋白陽性率及mRNA相對表達量均高于對照組(均P<0.05)，這提示在宮頸癌患者中CD49f呈高表達。此外，我們發現，與對照組相比，宮頸癌組血清CD3+T淋巴細胞、CD4+T淋巴細胞水平以及CD4+/CD8+比值降低，CD8+T淋巴細胞、自然殺傷細胞以及IAP水平上升(P<0.05)；同時，宮頸癌患者CD49f mRNA表達水平與血清IAP水平、CD8+T淋巴細胞水平、自然殺傷細胞水平呈正相關，而與CD3+和CD4+T淋巴細胞水平均呈負相關(P<0.05)。這提示在宮頸癌患者中，CD49f的高表達可觸發特異性CD8+毒性T細胞的活化，而抑制CD3+T淋巴細胞和CD4+T淋巴細胞活化。

既往的研究已經證實，很多生物學物質的高表達與宮頸癌的不良預后有關。例如，羅舒等[16]的研究表明，宮頸癌組織中DNA(胞嘧啶-5)-甲基轉移酶1[DNA(cytosine-5-)-methyltransferase 1,DNMT1] 陽性細胞率顯著高于正常組織及癌旁組織；且隨著癌組織中 DNMT1 陽性細胞百分率的提高，宮頸癌的結局變得更差。侯立春等[17]的研究也表明，醌氧化還原酶1 蛋白高表達可能是評估宮頸癌預后不良的生物學指標。但是，目前尚無有關CD49f與宮頸癌的不良預后的研究。本研究Cox回歸分析結果顯示，在排除其他的混雜因素后，CD49f mRNA的表達水平與患者的生存情況有關，其表達水平越高，患者死亡風險越高(P<0.05)。

然而，本研究存在一定的局限性：首先，對于CD49f與免疫指標的關系，我們只選取了一部分指標進行分析，其他免疫指標是否有這樣的相關性，需要進一步研究才能確認。其次，宮頸癌組的樣本量較少，在生存率方面的統計會存在較大的誤差，需要大樣本來佐證宮頸癌患者CD49f高表達與患者不良生存結局的相關性。

總之，宮頸癌患者癌組織中CD49f呈高表達，其或可導致患者的免疫指標水平出現異常，且是影響患者生存結局的因素之一。