骨橋蛋白表達與胰腺癌患者臨床特征及預后的關系

劉亮，朱旭，張超，韓曉書

撫順市中心醫院消化內科，遼寧 撫順 113006

胰腺癌是一種常見的消化道腫瘤，其惡性程度高、易浸潤轉移、預后較差，患者的5年生存率不足5%，近年來國內外胰腺癌的發病率均呈明顯上升趨勢，嚴重威脅患者的生命安全[1]。早期診療和評估病情對于延長胰腺癌患者的生存時間、改善其預后十分關鍵。臨床研究認為，胰腺癌預后差與腫瘤的浸潤性生長、早期轉移等密切相關[2-3]。骨橋蛋白（osteopontin，OPN）是一種糖基化磷蛋白，參與肺癌、肝癌、胃癌、乳腺癌等多種實體瘤的轉移、浸潤、侵襲等過程[4-6]。因此，推測OPN與胰腺癌的預后具有一定的關系。目前關于OPN在胰腺癌組織中的表達及與患者臨床特征關系的研究卻鮮有報道，且尚未有準確定論。基于上述理論基礎及既往文獻報道，本研究采用免疫組織化學染色法檢測胰腺癌組織中OPN的表達情況，并分析其與胰腺癌患者臨床特征及預后的關系，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2015年1月至2016年12月撫順市中心醫院收治的胰腺癌患者的病歷資料。納入標準：①經病理診斷證實為胰腺導管腺癌，符合《胰腺癌診治指南（2014版）》[7]中胰腺癌的診斷標準；②非急診手術患者；③術前未接受過放化療等抗腫瘤治療；④病理組織接受OPN檢測；⑤病歷資料及隨訪資料完整。排除標準：①生存時間＜6個月；②合并其他部位惡性腫瘤；③合并自身免疫疾病及全身疾患；④合并血液系統疾病；⑤合并嚴重軀體疾病；⑥合并全身急慢性感染；⑦合并心臟病、糖尿病、冠心病等嚴重內科疾病；⑧合并器質性功能障礙。依據納入和排除標準，本研究共納入75例胰腺癌患者，收集胰腺癌組織75例及癌旁組織（距胰腺癌組織≥5 cm）30例。

1.2 免疫組織化學染色方法及結果判定

采用免疫組織化學鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連結（streptavidin-perosidase，SP）法檢測OPN的表達情況。術中取得胰腺癌組織或癌旁組織，石蠟包埋后，4 μm厚連續切片，常規脫蠟水化后，63℃烤箱中烘烤1 h，然后分別置于二甲苯及100%、90%、80%乙醇中浸泡，以封閉內源性過氧化物酶活性。采用枸櫞酸鹽進行微波抗原修復，降至室溫后水洗，然后磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）沖洗3次，每次5 min，滴加阻斷劑，置于室溫下15 min。滴加一抗（工作濃度為1∶600），4 ℃孵育24 h，PBS沖洗3次，每次1 min；滴加生物素標記的二抗，室溫孵育30 min，PBS沖洗3次，每次3 min；滴加SP試劑，37℃孵育1 h，二氨基聯苯胺（diaminobenzidine，DAB）顯色，蘇木素復染，脫水、干燥、中性樹脂封片。采用PBS代替一抗作為陰性對照。

OPN陽性主要表現為棕黃色顆粒沉著。每張切片隨機選擇5個高倍視野進行評估，根據染色強度及陽性細胞百分比進行半定量分析。染色強度評分：無色為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，黃褐色為3分。陽性細胞百分比評分：陽性細胞百分比≤5%為0分，5%＜陽性細胞百分比≤25%為1分，25%＜陽性細胞百分比≤50%為2分，陽性細胞百分比＞50%為3分。染色強度評分與陽性細胞百分比評分相加，0～3分為陰性，≥4分為陽性[8-9]。

1.3 觀察指標

比較胰腺癌組織和癌旁組織中OPN的表達情況，分析胰腺癌組織中OPN表達與患者臨床特征（性別、年齡、腫瘤直徑、臨床分期、分化程度、淋巴結轉移情況）的關系。采用門診、電話隨訪或走訪等形式對患者進行3年隨訪，每3個月隨訪1次，隨訪截止時間為2019年12月，記錄所有患者的生存時間，分析胰腺癌患者預后的影響因素。

1.4 統計學方法

采用SPSS 22.0軟件對數據進行統計分析，計量資料以均數±標準差（±s）表示，組間比較采用t檢驗；計數資料以例數和率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗。采用Logistic回歸模型進行多因素分析。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 胰腺癌組織和癌旁組織中OPN表達情況的比較

OPN陽性表達主要位于細胞質中。胰腺癌組織中OPN的陽性表達率為65.33%（49/75），明顯高于癌旁組織的20.00%（6/30），差異有統計學意義（χ2=17.655，P=0.000）。

2.2 不同臨床特征胰腺癌患者胰腺癌組織中OPN表達情況的比較

不同性別、年齡、腫瘤直徑的胰腺癌患者胰腺癌組織中OPN的陽性表達率比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。臨床分期為Ⅲ～Ⅳ期、中低分化、有淋巴結轉移的胰腺癌患者胰腺癌組織中OPN的陽性表達率分別高于臨床分期為Ⅰ～Ⅱ期、高分化、無淋巴結轉移的患者，差異均有統計學意義（P＜0.05）。（表1）

表1 不同臨床特征胰腺癌患者胰腺癌組織中OPN表達情況的比較（ n=75）

2.3 生存情況

截至隨訪終點，所有患者均全部完成隨訪，75例胰腺癌患者中，15例患者生存，60例患者死亡，3年生存率為20.00%（15/75）。

2.4 胰腺癌患者預后影響因素的單因素分析

不同性別、腫瘤直徑的胰腺癌患者的3年生存率比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。年齡＜55歲、臨床分期為Ⅰ～Ⅱ期、高分化、無淋巴結轉移、OPN陰性表達的胰腺癌患者的3年生存率分別高于年齡≥55歲、臨床分期為Ⅲ～Ⅳ期、中低分化、有淋巴結轉移、OPN陽性表達的患者，差異均有統計學意義（P＜0.05）。（表2）

表2 胰腺癌患者預后影響因素的單因素分析（ n=75）

2.5 胰腺癌患者預后影響因素的多因素Logistic回歸分析

以單因素分析中差異有統計學意義的因素（年齡、臨床分期、分化程度、淋巴結轉移及OPN表達情況）作為自變量，以胰腺癌患者預后作為因變量進行多因素Logistic回歸分析，結果顯示，臨床分期、分化程度、淋巴結轉移情況及OPN表達情況均是胰腺癌患者預后的獨立影響因素（P＜0.05）。（表3）

表3 胰腺癌患者預后影響因素的多因素Logistic回歸分析（ n=75）

3 討論

胰腺癌是目前臨床中預后最差的惡性腫瘤之一，以手術、放化療為主的傳統治療方式療效有限，患者的生存時間較短[10]。研究認為，胰腺癌患者的生存時間與諸多因素密切相關，而腫瘤的浸潤生長及轉移則是影響預后的重要原因，因此，浸潤轉移相關蛋白表達情況的分析是臨床研究熱點及改善胰腺癌預后的關鍵[11-12]。OPN是一種分泌型糖基化磷蛋白，廣泛存在于機體體液、胃腸道、胰腺、肺等組織中，且在細胞的黏附遷移、組織修復及信號轉導中發揮重要作用[13]。隨著腫瘤研究的不斷深入，研究發現OPN參與了多種實體瘤的侵襲、轉移等過程，可作為腫瘤轉移的標志物及預后指標[14-15]。關于OPN參與腫瘤侵襲、轉移、轉化等過程的作用機制，相關研究指出，OPN能夠激活核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）信號轉導通路，活化NF-κB，并使其由細胞質進入細胞核，與轉移相關基因位點或κ位點結合，增強轉移相關分子的活性，提高其表達水平，促進腫瘤細胞的侵襲、轉移[16-17]。國外研究指出，腫瘤細胞或基質細胞產生的OPN均能夠促進腫瘤細胞的浸潤轉移，在細胞、動物實驗及臨床實體瘤試驗中，均能夠得出OPN與腫瘤轉移密切相關的結論[18]。OPN又稱為早期T淋巴細胞活化因子，是一種多功能細胞外基質蛋白，不僅能夠影響腫瘤遷移、侵襲中細胞的轉化功能，還可影響宿主細胞的免疫功能。OPN與CD44分子結合后，可增加髓系來源抑制性細胞（myeloid-derived suppressor cell，MDSC）的生成，發揮免疫抑制功能，從而逃避腫瘤免疫，促進腫瘤細胞的浸潤轉移。

本研究比較了OPN在胰腺癌組織與癌旁組織中的表達情況，結果顯示，OPN陽性表達主要位于細胞質中，胰腺癌組織中OPN的陽性表達率為65.33%，明顯高于癌旁組織的20.00%，差異有統計學意義（P＜0.01），說明OPN在胰腺癌組織中高表達。國外相關研究表明，與正常胰腺組織比較，胰腺導管癌組織中OPN過表達，且胰腺癌患者血漿中OPN的濃度亦明顯升高，與本研究結果基本一致[19]。本研究進一步比較了不同臨床特征胰腺癌患者胰腺癌組織中OPN的表達情況，結果顯示，臨床分期為Ⅲ～Ⅳ期、中低分化、有淋巴結轉移的胰腺癌患者胰腺癌組織中OPN的陽性表達率分別高于臨床分期為Ⅰ～Ⅱ期、高分化、無淋巴結轉移的患者，差異均有統計學意義（P＜0.05），說明OPN陽性表達與胰腺癌患者的臨床分期、分化程度及淋巴結轉移情況有關，臨床分期晚、腫瘤分化程度低、有淋巴結轉移的胰腺癌患者胰腺癌組織中OPN的陽性表達率較高。腫瘤分化程度預示著腫瘤的惡化程度，在臨床上能夠提示患者的預后情況，而臨床分期及淋巴結轉移則通常被認為是預測患者預后的重要指標[20]。以上結果說明OPN在胰腺癌病情進展、腫瘤浸潤轉移中均發揮重要作用，并影響患者預后。

美國國家衛生研究院的報告指出，胰腺癌患者的1年生存率為8%，5年生存率為3%，中位生存時間為2～3個月[21]。本研究通過3年的隨訪發現，75例胰腺癌患者的3年生存率為20.00%，略高于上述研究報道的結果，可能與本研究納入的樣本量少、統計學分析存在偏倚有關。胰腺癌患者預后受多種因素影響，本研究采用單因素及多因素Logistic回歸模型分析胰腺癌患者預后的影響因素，結果顯示，年齡＜55歲、臨床分期為Ⅰ～Ⅱ期、高分化、無淋巴結轉移、OPN陰性表達的胰腺癌患者的3年生存率分別高于年齡≥55歲、臨床分期為Ⅲ～Ⅳ期、中低分化、有淋巴結轉移、OPN陽性表達的患者，差異均有統計學意義（P＜0.05）；臨床分期、分化程度、淋巴結轉移情況及OPN表達情況均是胰腺癌患者預后的獨立影響因素（P＜0.05），說明臨床分期為Ⅲ～Ⅳ期、中低分化、有淋巴結轉移、OPN陽性患者的預后往往更差。OPN陽性的胰腺癌患者大多進展至晚期，且存在淋巴結轉移，因此生存時間更短，預后不良，提示OPN能夠作為評估胰腺癌病情及預后的重要輔助指標。

綜上所述，胰腺癌組織中OPN高表達，且OPN陽性表達與胰腺癌患者的臨床分期、分化程度及淋巴結轉移情況有關。OPN表達情況是胰腺癌患者預后的獨立影響因素，OPN陽性表達患者的預后較差，生存時間較短。