增殖抑制基因/線粒體融合蛋白2在膀胱癌中的表達及意義△

吳穎露，白云，熊艷杰，胡芬

華北理工大學1生命科學學院2018級生物技術專業二班，2生命科學學院，河北 唐山063000

3華北理工大學附屬醫院病理科，河北 唐山 063000

在泌尿系統惡性腫瘤中膀胱癌發病率居世界第二位[1]，90%的患者為尿路上皮癌。近些年，分子生物學領域研究不斷深入，生物技術不斷更新，發現膀胱癌是多種基因參與并且發生突變和裂變的過程。增殖抑制基因/線粒體融合蛋白2（hyperplasia suppressor gene/mitofusin 2；HSG/MFN2）與細胞增殖信息傳遞密切相關，對線粒體功能有著重要作用，參與線粒體融合分裂、增殖凋亡等生物學過程。本研究采用免疫組化和蛋白質印跡法（Western blot）檢測HSG/MFN2在膀胱癌組織中的表達情況，探討其在膀胱癌發生發展過程中的作用。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2015年3月至2017年8月于華北理工大學附屬醫院泌尿外科行手術切除的膀胱癌患者的病歷資料。所有患者均經手術病理確診，手術前均未經過任何化療、放療及抗腫瘤藥物治療。共納入50例膀胱癌患者，其中男28例，女22例，年齡35～75歲，平均（57.7±8.2）歲。選取膀胱癌患者的膀胱癌組織石蠟標本50例及癌旁正常組織石蠟標本20例。

1.2 主要試劑

本研究所用儀器由華北理工大學實驗中心提供，兔抗鼠多克隆HSG抗體購自美國santacrua公司；鼠單克隆β-actin抗體購自美國sigma公司；二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白定量試劑盒購自美國Therm Scientific公司；辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔免疫球蛋白G（immunoglobulin G，IgG）購自杭州聯科生物技術有限公司；SP-9001免疫組化染色試劑盒、二氨基聯苯胺（diaminobenzidine，DAB）及枸櫞酸鹽均購自北京中杉金橋生物技術有限公司。

1.3 免疫組化方法

將收集的石蠟標本按常規處理后4 μm連續切片，進行梯度酒精脫水、脫蠟，按照免疫組化試劑盒說明書進行操作，一抗用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）代替陰性對照。結果判讀：HSG/MFN2蛋白陽性反應主要定位于細胞質，呈棕黃色顆粒。根據染色強度和陽性細胞所占百分比的得分之和進行陽性細胞評定。染色強度：未染色為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分；陽性細胞所占百分比：無陽性細胞為0分，≤25%為1分，26%～50%為2分，＞50%為3分；根據二者得分之和判定結果，0～2分為陰性，3～6分為陽性。

1.4 Western blot方法

將標本從-80℃超低溫冰箱中取出研碎，經過蛋白裂解液提取總蛋白，用Bradford法測定蛋白濃度，每組取20 μg用于檢測不同膀胱組織中HSG/MFN2蛋白含量，經十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulphate-polyacryl amide gel electrophoresis，SDS-PAGE），聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜電轉印，50 g/L脫脂奶粉封閉過夜，加入一抗進行雜交，洗膜后加入二抗雜交，再次洗膜后DAB顯色，通過凝膠成像系統讀取條帶密度值進行分析，測定出各組蛋白條帶與β-actin的比值作為蛋白相對表達量。

1.5 統計學方法

采用SPSS 13.0統計軟件進行數據分析，計量資料以均數±標準差（±s）表示，組間比較采用t檢驗；計數資料以例數及率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗；以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 膀胱癌及癌旁正常組織中HSG/MFN 2蛋白表達情況的比較

膀胱癌組織中HSG/MFN2蛋白的陽性表達率為78%，高于癌旁正常組織的20%，差異有統計學意義（P＜0.05）。膀胱癌組織中HSG/MFN2蛋白相對表達量為（42.75±2.11），高于癌旁正常組織的（24.78±3.63），差異有統計學意義（P＜0.05）。（圖1、圖2、表1）

表1 膀胱癌及癌旁正常組織中HSG/MFN 2蛋白相對表達量及陽性表達情況的比較

2.2 不同臨床特征的膀胱癌患者的膀胱癌組織中HS G/MFN 2蛋白表達情況的比較

不同分化程度、TNM分期和生長方式膀胱癌患者的膀胱癌組織中HSG/MFN2蛋白陽性表達率比較，差異均有統計學意義（P＜0.05）；不同年齡及是否淋巴結轉移、肌層浸潤膀胱癌患者的膀胱癌組織中HSG/MFN2蛋白陽性表達率比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。（表2）

表2 不同臨床特征的膀胱癌患者的膀胱癌組織中HSG/MFN 2蛋白表達情況的比較（ n=50）

3 討論

膀胱癌的發生與家族遺傳或基因、細胞因子突變有關，影響信號通路，改變細胞代謝過程，導致多種基因和信號轉導通路過度表達，臨床上隨著病情的進展，患者出現了高腫瘤臨床負荷癥狀[2-3]。膀胱癌的發展機制需要血清學腫瘤指標的進一步診斷。HSG/MFN2是中國學者陳光慧研究大鼠血管平滑肌細胞利用差異顯示技術分離得到的基因，命名為細胞增殖抑制基因，后又命名為線粒體融合蛋白2，它位于線粒體外膜，由757個氨基酸殘基組成，是能夠介導線粒體融合、分裂，對線粒體的形態和功能有著重要調節作用的蛋白質[4-5]，與細胞周期密切關聯[6]，并且是一種高度保守的跨膜GTP酶，在腫瘤浸潤、細胞惡變和轉移過程中起著決定性作用。HSG/MFN2的抗腫瘤作用與Ras信號通路下游的絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）通路有關[7-8]，能夠傳遞Ca2+信號[9]，應激內質網、細胞凋亡等活動。HSG/MFN2過表達促進了線粒體膜與線粒體的緊密結合，增加線粒體的融合度，線粒體延長擴大，另外發現高表達的細胞在G1期細胞被阻滯，S期及G2期細胞減少。

本研究通過免疫組化和Westen blot法對HSG/MFN2蛋白在膀胱癌及癌旁正常組織中的表達情況進行檢測，發現在膀胱癌組織中HSG/MFN2蛋白陽性表達率高于癌旁正常組織，相對表達量高于癌旁正常組織。在哺乳動物中，線粒體不斷地融合分裂，通過這種方式維持其形態結構的動態平衡，腫瘤組織在機體運行過程中代謝過快，線粒體不斷調整功能維持本身所需要的能量，因此加快了線粒體的運行，出現HSG/MFN2蛋白在膀胱癌組織中過表達，與丁煥然等[10]在肺癌組織及郭桃英和潘玫[11]在卵巢上皮性癌組織中的檢測結果一致，說明HSG/MFN2蛋白可能是膀胱癌的一個潛在的生物標志物，促進線粒體不斷分解和融合蛋白活性[12]，平滑肌細胞與α-肌動蛋白的相互作用[13]，改變肌細胞功能。另外，本研究結果顯示，HSG/MFN2蛋白在膀胱癌中的表達與分化程度、TNM分期和生長方式有關，隨著腫瘤分化程度的加深，HSG/MFN2蛋白陽性表達率越高，說明HSG/MFN2具有促進腫瘤浸潤和轉移的作用；隨著TNM分期升高，HSG/MFN2陽性表達率降低，說明在代謝過程中HSG/MFN2誘導腫瘤細胞凋亡并抑制腫瘤細胞增殖[14]。

綜上所述，在膀胱癌組織中HSG/MFN2陽性表達率提高，相對表達量上調，對膀胱組織病變的發展過程有著重要的參與和調控作用。