應用PCR擴增方法對一起豬呼吸道混合感染的診斷

章國永，王曉杜

(蒼南縣動物疫病預防控制中心，浙江 溫州 325800；2.浙江農林大學)

豬呼吸道疾病，臨床以咳嗽、氣喘、張口呼吸、生長緩慢為特征，病理剖檢以肺部發生肉樣或肝樣病變，肺門淋巴結腫大為主，在全世界廣泛流行。單純感染豬肺炎支原體的豬只死亡率較低，但發病率高，且常常誘發其他病原微生物感染，引起臨床癥狀加重、病死率增加，給養殖戶造成嚴重的經濟損失[1]。可以通過體外培養、多克隆抗體免疫熒光法[2-3]、PCR[4]等方法對豬肺炎支原體進行診斷。但是體外培養條件苛刻，現在常常用PCR的方法進行快速診斷。

1 發病情況

杭州某地方品種豬場，存欄300多頭，該場管理不規范，沒有進行正規的群體性免疫。在2014年7-8月份，筆者在該豬場實習，期間發現該場豬群出現與豬喘氣病相似的臨床癥狀。豬群呈群體性間歇性咳嗽，3-4月齡的育肥豬呈現張口喘氣(時間持續在30 s左右)，間歇性的咳嗽，劇烈運動后更加明顯，腹式呼吸，甚至犬坐式呼吸等呼吸道疾病癥狀。病豬精神萎靡、食欲不振、生長緩慢，漸行性消瘦。有些病豬體溫升高至41～42℃，到病程后期，體溫低下，呼吸極度困難，伴有泡沫狀的口鼻分泌液，死亡后4～5 h有帶血樣的鼻液流出(見圖1所示)。5月齡及以上的育肥豬，表現為運動氣喘、拱背伸頸、咳嗽、毛發粗糙，未見豬只死亡。

圖1 病豬臨床癥狀

2 病理剖檢結果

病理變化尸體剖檢眼觀病變主要在肺部。剖檢病豬10頭，可以發現9頭肺葉有病變跡象，肺腫大、出血，呈暗紅色、灰白色、淺紅色，界限明顯(如圖2-1、圖2-3所示)。硬度增加，外觀呈“鮮肉樣”、“蝦肉樣”病變(如圖2-2、圖2-4所示)。7頭頜下淋巴結、腸系膜、腹股溝等處淋巴結腫大出血或壞死。其中有1頭病死豬病程一周多，每天用抗生素治療，死后發現該豬腸系膜粘連，胰臟、脾臟等器官萎縮壞死，皮膚出現紫色斑點。采集病死豬，病變明顯的器官，肺臟、淋巴、小腸、脾臟等，用于后續實驗室診斷。

圖2 病死豬剖檢結果

3 實驗室診斷方法與結果

根據參考文獻報導[5]，豬肺炎支原體(ATCC 25934)外顯性p36(948 bp) 蛋白基因，構建檢測豬肺炎支原體(948 bp)引物FSp36-RSp36，根據豬鼻支原體p37外顯性蛋白基因，構建一對引物：Sp37-Asp37，用于檢測豬鼻支原體(346 bp)。豬圓環病毒由浙江農林大學申老師實驗室根據PCV2的ORF2基因設計的引物P20RF2F-P20RF2R，對病料進行PCR擴增鑒定后，送至上海生物工程有限公司合成，引物名稱、核苷酸序列、目的基因大小如表1所示。

表1 PCR引物名稱及其序列

3.1圓環病毒鑒別診斷 圓環病毒感染可引起豬群免疫損傷，是引起豬呼吸道疾病綜合征(PRDC)的病原體之一。而該養殖場豬群以呼吸道疾病為主，病死豬很可能因為豬群免疫損傷繼發支原體感染，導致死亡率增加，故有必要對豬群進行PCV2的鑒別診斷。

用引物(P2ORF2F-P2ORF2R)檢測豬圓環病毒(667 bp)。結果如圖3所示。2-10號樣電泳結果呈陽性，陽性率80%(95% CI=44.4%, 97.5%)，表明這8頭豬均受到圓環病毒感染。

圖3 圓環病毒-ORF2基因PCR擴增產物鑒定

3.2豬鼻支原體檢測結果 豬鼻支原體，也可粘附到豬的呼吸道上皮細胞上，引起豬的肺炎，還可能引起漿膜炎、中耳炎等臨床癥狀[6]，為了與豬肺炎支原體做出鑒別診斷，本研究用引物(Sp37-Asp37)檢測10頭病死豬肺部組織樣本，結果如圖4所示，僅9號樣電泳結果呈陽性，陽性率10%(95% CI=0.3%, 44.5%)，表明10頭豬中僅一頭豬受到鼻支原體感染，說明該養殖場主要的病原不是豬鼻支原體。

圖4 豬鼻炎支原體-p37基因PCR擴增產物鑒定

3.3豬肺炎支原體檢測結果 用該對引物(FSp36-RSp36)檢測10頭病死豬肺部組織樣本，結果如圖5所示。3、4、6、7、8、9號樣電泳結果呈陽性，其中3、6號樣本呈弱陽性，陽性率60%(95% CI=26.2%, 87.8%)。表明這6頭豬均受到豬肺炎支原體感染，初步說明該病的病原體為豬肺炎支原體。

圖5 豬肺炎支原體-P36基因PCR擴增產物鑒定

4 討論與結論

豬氣喘病是地方性豬場的慢性呼吸道疾病，不同品種、性別、年齡的豬均可感染豬肺炎支原體，引起豬的氣喘病。本研究對10頭病死豬進行病理剖檢，發現肺出血，呈暗紅色、淺紅色，“鮮肉樣”、“蝦肉樣”病變。采集處理病死豬的肺臟，用PCR方法進行實驗室診斷，結果顯示：圓環病毒陽性率80%(CI 95%=44.4%-97.5%)，豬鼻支原體陽性率10%(CI 95%=0.3%-44.5%)，豬肺炎支原體陽性率60%(CI 95%=26.2%-87.8%)。說明該豬場很可能嚴重受到PCV2污染，引起豬免疫損傷，造成免疫力低下，繼發支原體感染，增加死亡率。豬鼻支原體的陽性率遠低于豬肺炎支原體，說明該豬場的氣喘病很可能是由于豬肺炎支原體引起。

結合臨床癥狀、病理剖檢和PCR診斷三者的結果，表明該豬場確實受到圓環病毒和肺炎支原體混合感染。該養殖場豬圓環病毒疫苗和豬肺炎支原體疫苗是不納在常規疫苗之內的，建議豬場將這兩種疫苗列入免疫計劃之內，并加強飼養管理，建立科學養殖觀念。