貴州不同海拔地區光葉紫花苕DNA甲基化多態性分析

王子苑， 舒健虹， 王小利， 尚以順

(貴州省農業科學院 草業研究所， 貴州 貴陽 550006)

光葉紫花苕(ViciavillosaRothvar.glabresensKoch)又名光葉紫花苕子、稀毛苕子等，為越年生或一年生雙子葉植物綱豆科巢菜屬植物，其具有適應性廣、生物量大、耐寒、耐旱、耐貧瘠等特點。我國于20世紀40年代引入江蘇，而后在河南、山東、安徽、湖北、云南、四川、貴州、新疆等省市推廣栽培。光葉紫花苕作為豆科綠肥，有特殊的生物固氮能力，能增加土壤肥力，在貧瘠土地上連續種植2～3季，土壤肥力能得到明顯提升[1]。同時，光葉紫花苕適口性好，柔嫩多汁，蛋白質含量高，碳水化合物、維生素和礦物質含量豐富，是冬春季節畜禽主要的青綠飼草來源。徐然等[2]分析表明，初花期光葉紫花苕干物質含量28.08%，粗蛋白含量25.01%，中性洗滌纖維含量為43.1%，酸性洗滌纖維含量為30.8%。目前，關于光葉紫花苕研究主要集中在栽培管理技術[3-6]、種質資源評價[7-8]和飼料利用[9-10]等方面，而在分子生物學層面對光葉紫花苕遺傳多樣性的研究甚少。

DNA甲基化是表觀遺傳修飾的主要方式之一，能對生物體內或外界環境的刺激作出響應，在不改變DNA一級結構前提下參與基因的表達調控，從而影響生物體的表型可塑性和環境適應性[11]，在植物生長發育過程中起重要作用。施江等[12]研究表明，遮蔭顯著誘導半夏基因組甲基化水平的提升；SHELDON等[13]研究發現，擬南芥在開花過程中由于DNA甲基化水平的降低，導致開花基因表達下調而延遲開花；陳家慧等[14]對不同甘蔗品種DNA甲基化水平分析發現，DNA甲基化在甘蔗生長過程中(伸長期和成熟期)頻繁發生，并且不同品種之間甲基化模式也存在差異。筆者等利用甲基化敏感擴增多態性(Methylation Sensitive Amplification Polymorphism，MSAP)技術，對貴州境內海拔差異較大的2個地區光葉紫花苕種子進行基因組甲基化多態性檢測，旨在研究不同海拔高度對其DNA甲基化水平的影響，為光葉紫花苕在環境適應性方面的表觀遺傳機制研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試的光葉紫花苕種子2020年5月18日分別采集于貴州省大方縣和興義市市。大方縣海拔1 256 m,E105°42′54″,N27°3′21″;興義市海拔1 523 m,E104°47′36″,N25°7′29″。

1.2 基因組DNA提取與MSAP分析

采用改良CTAB法[15]對光葉紫花苕種子進行基因組DNA提取，MSAP分析參照王子苑等[16]的方法實施。試驗所用接頭和引物序列信息見表1。

表1 接頭和引物序列

1.3 數據處理

PCR擴增產物的電泳位置在凝膠的某個相同遷移率位置上有DNA條帶記為1，無DNA條帶記為0，獲得01矩陣，最終得到24對引物的01數據并進行甲基化分析。

2 結果與分析

2.1 DNA提取

瓊脂糖電泳檢測提取的基因組DNA(圖1)主帶清晰，基本沒有降解，可以進行后續試驗。

2.2 預擴增電泳檢測

所提取DNA通過1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測表明(圖2)，預擴產物符合MSAP選擴模板要求。

2.3 不同海拔地區光葉紫花苕甲基化分析

根據2種同裂酶HpaⅡ (H)和MspⅠ(M)識別CCGG序列上甲基化胞嘧啶的敏感性不同，將其與內切酶EcoRⅠ(E)組合對基因組DNA進行雙酶切，酶切后的MSAP帶型分為4類。 Ⅱ 類是非甲基化位點，E+H和E+M都有帶，說明CCGG位點未發生甲基化； Ⅱ 類是半甲基化位點，E+H有帶，E+M無帶，說明位點發生單鏈DNA外甲基化； Ⅲ類是全甲基化位點，E+H無帶，E+M有帶，說明位點發生雙鏈DNA內甲基化； Ⅳ類是超甲基化位點，E+H和E+M無帶，不計入甲基化范圍。

利用隨機的24對選擇性擴增引物對酶切后的光葉紫花苕樣本進行擴增，共擴增產生1 832個位點，部分MSAP擴增圖譜見圖3。根據光葉紫花苕MSAP條帶類型分析結果(表2)，在所有擴增位點中檢測出總甲基化位點大方為1 304個，興義為1 240個，總甲基化率分別為84.90%和80.73%。其中全甲基化條帶數分別為403條和393條，全甲基化率分別為67.32%和65.23%。半甲基化條帶數分別為270條和238條，半甲基化率為17.58%和15.49%。表明，大方地區光葉紫花苕DNA甲基化水平較高，且不同類型的條帶總數為Ⅳ> Ⅲ> Ⅱ >Ⅰ，說明不同海拔地區的甲基化均以內側胞嘧啶雙鏈甲基化為主。

2.4 不同海拔地區光葉紫花苕甲基化模式變化

按照引物在酶切擴增泳道上是否擴增出條帶，將甲基化模式分為A、B、C、D 4大類，即，有擴增帶計為“1”，無擴增帶計為“0”。如表3所示，A類包含3個亞類，為甲基化位點無變化。興義與大方光葉紫花苕相比，未發生甲基化變化的位點占總甲基化擴增位點數的9.90%；B類包含5個亞類，表現為甲基化程度降低，即去甲基化，興義與大方相比有42.58%的位點發生了去甲基化；C類包含5個亞類，表現為甲基化程度升高，興義與大方相比，44.73%的位點發生了甲基化；此外，還有一種較為復雜的“未知模式”將其歸為D類，變化率不超過總甲基化擴增位點的3%。說明，與興義地區的光葉紫花苕相比，大方地區去甲基化模式和甲基化模式并存，但以甲基化模式變化為主。

表2 不同海拔地區光葉紫花苕MSAP條帶類型

表3 不同海拔地區光葉紫花苕DNA甲基化模式

3 結論與討論

DNA甲基化是一種重要的表觀遺傳機制，不僅提供了基因表達的開關，而且一旦形成穩定的表型可以延續若干個世代[17-18]，BOYKO等[19]認為這種表觀遺傳改變可能引起脅迫誘導的基因進化。在眾多甲基化類型中，5-甲基胞嘧啶是真核生物體中最重要的一種甲基化存在形式，通過將S-腺苷甲硫氨酸提供的甲基在DNA甲基轉移酶的催化下，轉移到脫氧胞嘧啶上形成5-甲基胞嘧啶[20]。簡單地說，DNA甲基化是一種在DNA序列的胞嘧啶核苷酸的特定位置上共價加減甲基基團的一種基因修飾方式[21]。根據檢測目的不同，DNA甲基化檢測技術可分為基因組整體甲基化水平檢測和特定位點甲基化檢測，前者的典型檢測方法有高效液相色譜(HPLC)、毛細管電泳(CE)等[22]，研究表明，采用的MSAP技術能特定識別CCGG位點，具有操作簡便、靈敏度高、成本低等優點，在植物DNA甲基化檢測中較為廣泛地應用。

環境溫度的改變是影響植株生長發育和新陳代謝的重要因素之一。研究發現，藜麥葉片的葉綠素、可溶性蛋白以及抗壞血酸過氧化酶(APX)含量隨海拔的升高而降低，而超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)等抗氧化酶活性與海拔高度負相關，說明高海拔條件下太陽輻射強度增大，溫度降低，藜麥植株為了能正常生長發育對高海拔脅迫作出了相應的生理響應[23]。STEWARD等[24]研究玉米幼苗在冷應激(4℃)條件下的甲基化變化發現，其根部組織的基因組發生了低甲基化，并且只有在冷應激條件下轉錄的ZmMI1基因也發生了去甲基化，即便是經過7 d恢復，低甲基化水平也沒有恢復到正常水平。王芳等[25]研究表明，超低溫保存導致馬鈴薯基因組DNA發生了甲基化現象，其中以去甲基化變化為主。通常來說，DNA發生甲基化與基因的沉默有關，而DNA發生去甲基化會開啟基因表達。本研究采集來自不同海拔高度的光葉紫花苕樣本，對甲基化分析后發現，海拔較低的大方地區總甲基化率和半甲基化率分別低于高海拔興義地區4.17%和2.09%，說明低海拔地區DNA發生去甲基化現象高，與前人研究結果類似[26-27]，這種變化趨勢可能是植物通過改變甲基化水平和模式來調控環境應答基因網絡，并且這種甲基化的改變能延續給后代，從而增強當代或者后代的環境適應性。