南昌市辣椒疫病病原鑒定

強 遙， 廣業蘭， 秦雙林， 張凱東， 楊渭澄， 蔣軍喜*

(1.江西農業大學 農學院，江西 南昌 330045； 2.上海市崇明區長興鎮農業技術服務中心，上海 201913)

辣椒疫病是危害辣椒的主要病害之一[1]，近年來在江西省南昌市發生嚴重，對當地辣椒產量和品質造成嚴重影響。該病可危害辣椒莖桿、葉片和果實等部位，在病部產生暗綠色大面積軟腐癥狀，導致植株萎蔫直至死亡[2]。辣椒疫病的病原物為色菌界(Chromista)卵菌門(Oomycota)疫霉屬(Phytophthora)真菌，其主要種類為辣椒疫霉(PhytophthoracapsiciLeonian)[3-4]，但寄生疫霉(Phytophthoraparasitica)和煙草疫霉(Phytophthoranicotianae)也能引起辣椒疫病[5-6]。辣椒疫病作為南昌市一種重要的蔬菜病害，已從病原菌生物學、品種抗性及殺菌劑篩選等多方面進行了研究[7-8]，但未見對其進行系統病原鑒定的研究報道。鑒于此，從南昌市辣椒田間采集病樣，采用病原菌分離培養、回接致病性觀察及形態學和分子生物學相結合鑒定南昌市辣椒疫病的病原菌種類，以期為該病的防治和進一步研究提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 感病植株 2019年7月從南昌市郊采集呈典型癥狀的辣椒疫病病株。

1.1.2 試劑 Ezup 柱式真菌基因組DNA提取試劑盒，上海生工生物工程有限公司；ITS1/ITS4通用引物，2×Taq PCRMaster Mix，北京天根公司；5×TAE 緩沖液、無水乙醇、75%乙醇、0.1%升汞、瓊脂糖及2000 DNA marker，市購。

1.2 方法

1.2.1 病菌分離及純化 根據《植病研究法》[9]中描述的組織分離法，對病株樣品進行病菌分離。從病斑的病健交界處剪取3 mm×3 mm大小的組織塊，先將其在75%乙醇溶液中浸泡15 s，再用0.1%的升汞溶液消毒30 s，無菌水沖洗3次。隨即將處理好的組織塊移入胡蘿卜培養基(CA)平板上并置于26℃培養箱中培養，待菌落長出后挑取菌落邊緣的菌絲體進行病原菌純化，將獲得的菌株置于4℃下保存備用。

1.2.2 病原菌致病性測定 純化后的菌落培養性狀和形態特征一致，從中隨機選取2個菌株L1和L2測定其致病性。將分離獲得的菌株分別接種在CA平板上于26℃培養5 d，打取直徑5 mm的菌餅，同時制備濃度為1×106個/mL游動孢子懸浮液，分別采用菌餅接種法和游動孢子懸浮液針刺法對6葉期健康辣椒幼苗葉片和莖桿中部接種，并接種空白培養基和蒸餾水作對照。每個處理接種3株辣椒，3次重復。將接種幼苗在26℃培養箱內保濕培養，每天觀察和記載發病情況。

1.2.3 病原菌的鑒定

1) 形態學。將待鑒定菌株接種在CA平板中央，26℃、12 h/12 h光暗培養，逐日觀察菌落生長情況。待病原菌產生孢子囊后制片，在光學顯微鏡下觀察病原菌菌絲隔膜的有無、游動孢子囊以及游動孢子的形態特征，將獲得的觀察結果與文獻[10-12]對照，從形態上鑒定病原菌。

2) 分子生物學。隨機選取2個菌株進行分子生物學鑒定。將各菌株接入PDB培養基中26℃、160 r/min振蕩培養3 d，過濾菌絲體，用液氮研磨成粉末，采用Ezup柱式真菌基因組DNA提取試劑盒按其說明提取病原菌基因組DNA。利用真核生物通用引物ITS1/ITS4(ITS1：5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′；ITS4：5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)對提取的病原菌基因組DNA進行rDNA-ITS序列擴增。反應總體積25 μL：ITS1 /ITS4各1 μL，2×Taq MasterMix 12.5 μL，DNA模板2 μL，ddH2O 8.5 μL。反應程序：94℃預變性3 min；94℃變性30 s，57℃退火30 s，72℃延伸1 min，35個循環；72℃補平10 min。獲得的PCR產物用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測后送至上海生工生物工程有限公司進行測序，將測得的原始序列用DNAStar (Madison Wisconsin, USA)進行數據處理，用Blast工具在GenBank中進行序列同源性搜索，取相似性最高的序列和測定序列在Clustal V程序中進行完全比對，然后利用Mega 5.0以鄰位相連(Neighbor-joining，NJ)算法構建系統發育樹[13-14]。

2 結果與分析

2.1 病原菌的分離及形態特征鑒定

從病樣中共分離獲得16種真菌菌株，其培養性狀和形態特征一致。從圖1看出，在CA平板上菌落呈白色，邊緣整齊，菌絲稠密呈絨毛狀，氣生菌絲中等茂盛；菌落生長速率為13.5 mm/d，7 d后長滿整個平板。鏡檢發現，初期菌絲一般無隔，老熟菌絲或菌絲產生游動孢子囊時有隔。孢子囊卵圓形或近球形，有乳突，孢子囊大小(25.00～50.00) μm×(21.25～40.00) μm，長寬比1.00～1.50。孢子囊在水中釋放游動孢子，游動孢子腎形，雙鞭毛。綜合菌落形態、孢子囊及游動孢子形態大小，結合文獻[10-12]的形態特征描述，將辣椒疫病病原菌初步鑒定為辣椒疫霉(PhytophthoracapsiciLeonian)。

2.2 分離病原菌的回接試驗

從圖2看出，辣椒疫病在田間危害莖桿、葉片和果實等各部位，莖桿發病主要發生于莖基部及枝桿分叉處，病部暗綠色，皮層軟腐，易導致植株部分或全株萎蔫死亡；葉片和果實可在任意部位發病，病部表現大面積暗綠色軟腐，很快導致整葉和整果腐爛；田間潮濕時，在各病部表面易見一層白色稀疏的霉層。從圖3看出，菌餅接種，3 d后辣椒葉片出現大面積暗綠色水漬狀腐爛癥狀；游動孢子懸浮液接種莖桿，3 d后辣椒幼苗出現莖桿縊縮，5 d后出現整株萎蔫現象，1周后辣椒幼苗干枯致死，癥狀與辣椒疫病自然發病癥狀相符。對接種發病的病葉和病苗進行病原菌再分離，通過菌落和病原菌形態觀察以及ITS序列分析，表明再分離的病原物與原接種病菌一致。

2.3 病原菌的分子生物學鑒定

從圖4看出，菌株L1和L2的基因組DNA經rDNA-ITS區的PCR擴增后，均獲得長約840 bp的DNA片段；序列測定表明，2個菌株的rDNA-ITS的序列長度均為801 bp(不包括兩端引物序列)且序列完全相同，其在GenBank中的序列登錄號分別為MT740810和MT880222。將該片段序列在NCBI數據庫中進行Blast比對的結果顯示，菌株L1和L2與PhytophthoracapsicaOCPC13(登錄號：KC677815)的序列同源性最高，達99.88%。從GenBank數據庫中選取疫霉屬不同種的ITS序列，以Peronosporacacuminis作為外群構建系統發育樹(圖5)，菌株L1和L2與辣椒疫霉菌的rDNA-ITS 聚在一起，而外群菌株Peronosporacacuminis則以較遠的親緣關系處在系統發育樹的外圍。結合系統發育分析和菌株的形態特征及培養性狀，最終確定菌株L1和L2為辣椒疫霉(Phytophthoracapsici)。

3 結論與討論

通過對南昌市辣椒疫病樣品進行病原菌分離，共獲得16個培養性狀結果一致的真菌菌株，其具有相同的形態特征和大小測量值，且與文獻[8,10]對辣椒疫霉的形態特征和測量值相符；隨機選取2個菌株測定其rDNA-ITS序列，結果其序列完全相同且與GenBank中辣椒疫霉的對應序列具有99.88%的同源性；2個菌株的rDNA-ITS序列與辣椒疫霉菌在rDNA-ITS系統發育樹上處于同一分支；確定南昌市辣椒疫病的病原菌為辣椒疫霉(PhytophthoracapsiciLeonian)。