杜馬斯燃燒法測定玉米淀粉蛋白質含量

黃世群， 秦 琳， 文 婷， 仲伶俐， 趙 珊， 李 曦， 白 勝

(1.四川省農業科學院 分析測試中心， 四川 成都 610066； 2.四川省農業科學院 服務中心， 四川 成都 610066)

玉米淀粉為白色或微帶淡黃色有光澤細膩松散粉末，通過對玉米清理、浸泡(浸泡水含二氧化硫濃度為0.15%～0.20%)、粗碎、胚芽分離、磨碎、淀粉篩分、離心分離和干燥等一系列工藝流程未經改性提取而得。玉米淀粉作為原料或變性后廣泛應用在食品、醫藥、制糖、氨基酸、發酵、化工、造紙等行業[1-4]。通常食用玉米淀粉蛋白質測定采用凱氏定氮法[5-6]，但傳統凱氏定氮儀法測定玉米淀粉蛋白質前處理時，由于玉米淀粉吸水性強，細度細(干基，150 μm)，加酸后容易結成團塊，浸透不徹底，且與其他食品類相比需更長的消煮時間，又因玉米淀粉蛋白質含量較低，消耗標準溶液量少，測定時誤差相對較大，難以達到標準要求，往往需進行返工重復測定，導致測定工作效率較低。因此，探索簡便、快速、穩定的檢測方法且準確測定玉米淀粉蛋白質含量，對產品準確定級具有重要意義。

目前杜馬斯燃燒法廣泛應用于各類食品檢測中。王欽權等[7]以各類常見的食品為材料,分別采用凱氏定氮法和杜馬斯燃燒法測定其蛋白質含量，并對檢測原理、步驟及精密度、準確度、回收率進行對比研究。汪紅等[8]以芝麻、大豆、油菜和花生為研究對象，分別用杜馬斯燃燒法和凱氏定氮法測定4種樣品的粗蛋白含量,結果2種方法的測定值間沒有顯著性差異,但杜馬斯燃燒法比凱氏定氮法的測定精密度和準確度更高。楊雪嬌等[9]用杜馬斯法和凱氏法以各類食品為試驗材料測定其含氮量，其中大部分食品樣品杜馬斯法和凱氏法測定結果無顯著性差別。張秀蓮等[10]分別采用杜馬斯燃燒法和凱氏定氮法測定14個人參樣品的蛋白質含量，結果顯示2種測定方法測得的人參蛋白質含量差異不顯著(P>0.05)。目前，國內尚未見玉米淀粉蛋白質含量采用杜馬斯燃燒法進行測定的報道。鑒于此，采用杜馬斯燃燒法對玉米淀粉蛋白質含量進行測定，并與凱氏定氮儀法檢測結果進行比較分析,旨在為玉米淀粉蛋白質含量測定開辟新的更可靠的檢測方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 玉米淀粉樣品 玉米淀粉樣品為2019年四川省不同地區委托四川省農業科學院分析測試中心檢測的隨機抽取的26個玉米淀粉樣品(編號為1～26)，樣品均能滿足檢測要求。

1.1.2 主要儀器 rapid MAX N EXCEED 元素分析儀(德國Elementar 公司)，AUY 220電子天平(精度為0.0001 g)，自動Kjeltec定氮儀(瑞典，型號FOSS2400)，消化爐(瑞典FOSS公司)。

1.1.3 主要試劑 混合催化劑，無水硫酸銅+硫酸鉀(3︰97)；濃硫酸，20 g/L 硼酸溶液，400 g/L氫氧化鈉溶液，0.0501 5 mol /L硫酸標準滴定溶液，混合指示劑(0.1%甲基紅乙醇溶液，0.1%溴甲酚綠乙醇溶液7 mL∶10 mL/L硼酸溶液)[11]，氧化銅，Pt催化劑，ESA-REGAINER，氧化鋁球，氫氧化鈉(黑色顆粒狀)，五氧化二磷。

1.1.4 氣體 氧氣(純度≥99.99%)，氦氣(純度≥99.99%)。

1.1.5 標準物質 天冬氨酸(N 10.52%，純度≥98%)，乙酰苯胺(N 10.15%，純度≥98%)，硫酸銨(N 21.21%，純度≥98%)；小麥粉(蛋白質15.8%±0.3%)，土壤標準品(N 0.081%±0.012%)。

1.2 方法

采用杜馬斯燃燒法和自動凱氏定氮儀法測定26個玉米淀粉樣品的蛋白質含量，每個樣品重復測定3次(其中，樣品7進行23次重復測定)，并對2種方法的測定結果進行對比分析。

1.2.1 自動凱氏定氮儀法 稱取1 g玉米淀粉，精確至0.000 1 g，倒入凱氏消化管中加入10 g催化劑〔五水合硫酸銅+硫酸鉀(3︰97)〕，搖勻，加12 mL硫酸后再搖至樣品完全浸透，放置2 h后置于消化爐上加熱升溫，當消化爐溫度達420℃進行消化1.5 h[11-12]，停止升溫并提起消煮架，可觀察到測試樣品呈綠色透明狀，待降溫后緩慢加入約40 mL去離子水，待稀釋液體冷卻后，置于FOSS2400全自動凱氏定氮儀上進行測定。儀器設置條件：硼酸溶液40 mL(內混有指示劑)，氫氧化鈉溶液70 mL，蒸餾時間3.5 min，蒸餾同時儀器自動用硫酸標準溶液進行滴定，當液體顏色滴定至淺灰紅色時，滴定終止，儀器自動記錄滴定體積?？瞻自囼?，通過測定標準物質乙酰苯胺和硫酸銨并根據測定值確定儀器處于正常狀態后，進行玉米淀粉樣品測定。結果以全氮含量×6.25所得值為玉米淀粉蛋白質含量。

1.2.2 杜馬斯燃燒法 稱取玉米淀粉1 g，精確至0.000 1 g，倒入儀器專用坩堝內，將坩堝放入進樣盤中的對應孔位號中。開啟rapid MAX N EXCEED型元素分析儀，并打開系統軟件，當燃燒管溫度達900℃以上、次級燃燒管接近900℃、TCD檢測器溫度升至59℃時，同時滿足氧氣壓力達0.25 MPa、氦氣壓力達0.38 MPa條件下，元素分析儀可以正常運行?？瞻自囼?，稱取標準參考物質天冬氨酸10.8 mg、80.6 mg、150.0 mg、200.3 mg、250.3 mg和302.7 mg，上機檢測，得標準曲線。然后通過測試標準物質小麥粉和土壤標準品并根據其含量確定儀器處于正常狀態并得出日校正因子，再進行供試樣品測定。輸入被測樣品稱樣量、名稱、校正因子及氮換算成蛋白質系數6.25，儀器設置條件：加氧時間120 s、加氧流速300 mL/min，每個單樣出峰到積分完成時間為6 min，樣品燃燒的同時儀器自動積峰，根據峰面積得出氮含量，儀器自動計算出被測樣品蛋白質含量。

1.3 數據統計分析

采用DPS對數據進行方差分析和多重比較，采用EXCEL進行線性回歸分析，P<0.05認為統計學檢驗有顯著性差異。

2 結果與分析

2.1 2種檢測方法的穩定性和精密度

2.1.1 穩定性 自動凱氏定氮儀法標準物質采用乙酰苯胺，乙酰苯胺量為17.6～61.1 mg，總氮含量為1.786～6.214 mg，以乙酰苯胺量為橫坐標，總氮含量為縱坐標，建立標準曲線(圖1)為y=0.102 1x-0.016 3(R2=0.999 9)。杜馬斯燃燒法標準物質采用天冬氨酸，總氮含量為1.136～ 31.844 mg，N的峰面積在3 066～81 576，以總氮含量為橫坐標，峰面積為縱坐標，建立標準曲線(圖2)為y=2 559.9x+335.35(R2=1)。2種方法的標準物質的稱樣量與測定值存在顯著的線性相關(R2≥0.999 9)，說明方法均穩定。

2.1.2 精密度 從表1看出，2種方法對3個標準物質的測定結果都接近于真實值。相對標準偏差(RSD)和相對誤差(RE)杜馬斯燃燒法較自動凱氏定氮儀法均低，說明杜馬斯燃燒法精密度更高，準確度更好。

表1 自動凱氏定氮儀法和杜馬斯燃燒法測定3種物質的含量(n=5)

2.2 2種方法測定的玉米淀粉蛋白質含量

2.2.1 對同一玉米淀粉樣品的重復測定 對樣品7進行23次重復蛋白質含量測定結果(圖3)表明，自動凱氏定氮儀法測定的蛋白質含量為0.247%～0.272%，最大相差0.025百分點；杜馬斯燃燒法測定的蛋白質含量為0.257%～0.285%，最大相差0.028百分點。在23次測定中，2種方法的測定值完全一致的有1次，自動凱氏定氮儀法測定值高于杜馬斯燃燒法的有2次，其余20次杜馬斯燃燒法測定值均略高于自動凱氏定氮儀法測定值(占比87.0%)。

2.2.2 對26個玉米淀粉樣品的測定 從表2看出，2種測定方法中，均表現為樣品15和樣品19與其他樣品差異顯著，其余24個樣品的差異均不顯著，表明2種測定方法的一致性較高。凱氏定氮法的RSD值為0.51%～4.64%，杜馬斯燃燒法的RSD值為0.52%～3.60%，均小于5%，說明2種方法精密度較高，穩定性較好。K/D值(凱氏定氮法與杜馬斯燃燒法測定值的比值)除樣品15和樣品19差異顯著外，其余24個樣品差異不顯著，K/D值均為0.931～1.055(接近1)，進一步說明2種方法的測定值較一致。

表2 杜馬斯燃燒法與自動凱氏定氮儀法測定的26個樣品的玉米淀粉蛋白質(n=3)

3 結論與討論

GB/T8885-2017《食用玉米淀粉》中規定，食用玉米淀粉的蛋白質測定方法按GB/T22427.10-2008《淀粉及其衍生物氮含量測定》標準中凱氏定氮法[5-6]。但實踐證明，采用傳統凱氏定氮儀法測定玉米淀粉蛋白質存在以下不足：一是前處理時由于玉米淀粉吸水性強，細度細(為150 μm)(干基)加酸后非常容易結成團塊，浸透不徹底；二是與其他食品類相比需要消煮的時間更長；三是由于玉米淀粉蛋白質含量較低，消耗標準溶液量少，導致誤差相對較大等。因此，開展了杜馬斯燃燒法測定玉米淀粉蛋白質的可行性研究。結果表明，杜馬斯燃燒法和自動凱氏定氮儀法2種方法均能準確測定玉米淀粉蛋白質含量，測定樣品時精密度和準確度均能滿足試驗要求。測定標準物質時杜馬斯燃燒法方法更穩定，測定值更接近真值，誤差更小，回收率高。同時，杜馬斯燃燒法方便、快速、環保、省時省工，僅需稱量后依次燃燒，不消煮、不用溶液滴定，只需更換耗材，完全避免了自動凱氏定氮儀法因樣品浸透硫酸不完全而消煮時糊化、消化不徹底、消耗標準溶液體積小導致誤差、配制各種溶液和指示劑耗時長用工多等缺點[13]。

2種方法相比，杜馬斯燃燒法測定的玉米淀粉蛋白質含量略高于自動凱氏定氮儀法，一方面可能是由于杜馬斯燃燒法的燃燒完全，另一方面可能因為玉米淀粉含有極少量的二氧化硫(SO2)，SO2屬于弱還原劑，溶于水后生成亞硫酸(H2SO3)，然后亞硫酸再跟氫氧化鈉(NaOH)反應，酸堿中和，這樣容易導致元素分析儀吸收管內的NaOH消耗較快，一旦更換不及時將導致吸收不完全，儀器會誤將SO2作為N計入峰面積致使測定值增大。因此，在采用杜馬斯燃燒法測定玉米淀粉蛋白質過程中，一定要關注吸收管內吸收劑NaOH的變色情況并及時更換，確保檢測數據的可靠性和準確性。