植物組織培養過程中存在的問題及預防措施

鄒 悅 劉文鈺

（沈陽工學院生命工程學院，遼寧 撫順113122）

植物組織培養又叫離體培養，指從植物體分離出符合需要的組織、器官或細胞、原生質體等，在無菌條件下將其接種在含有各種營養物質及植物激素的培養基上進行培養以獲得再生的完整植株或生產具有經濟價值的其他產品的技術。組織培養過程中常會發生一些問題，如材料污染、褐變和玻璃化等，嚴重影響組培效果，甚至導致組培失敗。現將植物組培過程中發生問題的原因及預防措施介紹如下。

1 材料污染

材料污染指組培過程中，培養基或培養材料滋生真菌、細菌等微生物，使培養材料不能正常生長和發育的現象。

1.1 污染的來源

植物組培過程中，所用工具、器械和接種室消毒不嚴密或技術操作不標準等均會導致操作環境受污染。污染原因按病原菌種類可分為細菌類污染和真菌類污染。細菌污染主要由介質的外植體消毒不徹底且操作不當引起的，真菌污染是由超凈工作臺衛生不合格、無菌室空氣不干凈、實驗人員操作不妥等引起的[1]。

1.2 污染的預防

1.2.1 環境、人員、用品的衛生要求

植物組培要求接種環境干凈衛生，操作人員接種前需進行嚴格的衛生處理，組培過程中使用的一次性用品必須保證一用一換。

1.2.2 外植體材料要求

生長在土壤中的塊根、塊莖和鱗莖帶菌量較多，表面積越大的外植體材料帶菌量相對越多，因此應盡量選擇幼嫩的莖尖、胚進行組織培養。王吉鳳等[2]在芍藥組織培養中發現，高溫多雨的環境有利于污染的發生，最佳的取材時間為3～5月份連續晴朗的下午。

1.2.3 培養基滅菌

目前組培容器的消毒主要采用高壓蒸汽滅菌法。滅菌操作時要嚴格遵守高壓蒸汽滅菌鍋的使用要求及注意事項。滅菌后需進行抽樣試驗培養，確保同批次滅菌培養基表面無細菌或真菌污染，以防后期發生污染造成更大損失。

2 材料褐變

培育的外植體褐變會嚴重影響外植體的生長與分化，甚至造成組培苗死亡，是目前植物組織培養中十分棘手的問題。

2.1 褐變產生的原因

材料褐變的原因和影響因素較為復雜，涉及外植體的選擇、培養條件以及培養方式等。

2.1.1 外植體的選擇

外植體的種類、取材部位、取材季節等是材料發生褐變的主要影響因素。研究表明，同一種植物，幼齡比成齡產生褐變的可能性小，取材小的外植體發生褐變可能性較大，取材季節以春秋兩季較適宜[3]。

2.1.2 外植體的培養條件

消毒時間越長外植體褐變越嚴重，光照和高溫都會加劇外植體褐變；培養基瓊脂的用量越少、無機鹽濃度越高，外植體發生褐變的幾率越大。

2.1.3 外植體的培養方式

一般情況下，莖段正向插入培養基比反向插入培養基，外植體發生褐變的幾率大；接種后放置時間越長外植體越易產生褐變。

2.2 材料褐變的預防

2.2.1 外植體材料的選用

由褐變的產生原因可知，應避免在夏季或冬季取材，宜選用大一些的幼齡外植體。若取材需求允許，盡量采集草本植物作外植體材料。

2.2.2 外植體的培養條件

外植體材料的消毒處理必須符合要求；組織培養的環境要求低溫避光，以降低植物細胞中酶的活性，從而避免褐變的產生；培養基配制時適當增加瓊脂用量，以降低無機鹽濃度，創造酸性的培養環境。

2.2.3 外植體的培養方式

若在科學選用外植體材料、滿足外植體培養條件的基礎上，外植體褐變防控效果仍不理想，可在培養基中適當添加抗褐變助劑，如有吸附作用的助劑活性炭和抗氧化劑硝酸銀等[4]。

3 材料玻璃化

玻璃化指在植物組織培養過程中，各種不適因素導致組培苗葉片卷曲畸形并出現嫩綠透明的現象。玻璃化普遍發生于自然界的多種植物中，會降低材料的存活能力，使其無法繼續展開后續的繼代、馴化、移栽及培養工作[5]。

3.1 玻璃化的成因

3.1.1 外植體材料

外植體材料的類別、取材部位以及材料的大小都能導致玻璃化發生，且顯著影響玻璃化程度。一般外植體新分化、分化程度較低的組織更易發生玻璃化。

3.1.2 培養條件

培養環境溫度過高、培養瓶的照光時間過長，培養材料易發生玻璃化；繼代培養代數越多，玻璃化發生的幾率越高、發生越嚴重。

3.1.3 培養基類型

提高基礎培養基中的NH4+濃度，會增加組培苗玻璃化發生的可能性；植物組織培養過程中，蔗糖不僅具有維持相對穩定滲透壓的能力，還有克服并減少材料玻璃化發生的作用。

3.2 材料玻璃化的預防措施

3.2.1 外植體的選用

選用植物中木質化、分化程度較高、個頭較大的組織進行植物組織培養。

3.2.2 培養環境

適宜的低溫環境可預防培養材料發生玻璃化；透氣性好的封口材料能提高培養瓶內的通氣度、降低培養瓶小環境濕度，可減少玻璃苗的發生。

3.2.3 培養基成分

減少培養基中NH4+的添加量，增加Ca2+的添加量，適當提高蔗糖濃度，適當減少細胞分裂素，可減輕玻璃化發生的程度；培養基中添加一定量的活性炭，不僅可降低培養材料玻璃化的發生率[6]，還能預防材料褐變。