鹽酸氨基葡萄糖含量測定研究進展

李 霞，楊海霞，趙國敏，袁曉如

（山東省藥學科學院 山東省生物藥物重點實驗室，山東 濟南 250101）

1 分光光度法

分光光度法包括N-甲基葡萄糖胺法（Elson-Morgan法）、Indol-Hcl法、茚三酮法、4-氨基-5-肼基-4H[1,2,4]-三唑-3-硫醇法（AHTT法）和京尼平法。

1.1 N-甲基葡萄糖胺法

用于測定游離的氨基糖，是GAH含量測定的常用方法，其原理是：GAH中的2-甲基葡糖胺在堿性條件下，與乙酰丙酮縮合，生成的色原與對二甲氨基苯甲醛在酸性條件下結合呈紅色，在525 nm左右波長處測定吸光度。翟詠紅等[4]用該法測定了復方制劑真靈活膠囊中GAH的含量，且另一成分硫酸軟骨素對GAH測定無干擾。馮傳平[5]用該法測定了氨基葡萄糖枸櫞酸鈣分散片中GAH的含量，枸櫞酸鈣與輔料均無干擾。許創偉等[6]由預處理后的蝦殼制備幾丁質，用鹽酸水解得D-GAH，優化水解工藝確定最佳工藝條件：水解鹽酸濃度11.7 mol/L，水解溫度95 ℃，水解時間4 h，采用紫外分光光度法，在420 nm處測定樣品中D-GAH的含量。

1.2 Indol-Hcl法

將過量亞硝酸與氨基己糖反應，脫氨基同時脫水，生成2, 5-己糖酐，與酸性的吲哚乙醇絡合生成桔紅色產物，在492 nm波長處測定吸光度。王維等[7]用該法測定了GAH的含量，并與Elson-Morgan法進行比較，結果表明Indol-Hcl法重現性較Elson-Morgan法好，且條件易于控制，對于成品的測定，用Indol-Hcl法精度高，但測定含抗壞血酸等雜質的D-GAH時，采用Elson-Morgan法雜質無干擾，精度更高。

1.3 茚三酮法

GAH與茚三酮反應后，溶液呈紫色，在570 nm波長處測定吸光度。Wu 等[8]用該法測定了GAH緩釋片中GAH的含量，研究了茚三酮濃度、反應時間、pH值、反應溫度、紫色穩定期和葡萄糖胺/茚三酮比對檢測結果的影響，優化了測定方法。

1.4 AHTT法

GAH被高碘酸氧化產生甲醛，與AHTT縮合后進一步氧化生成紫色化合物，在550 nm波長處測定吸光度。Abdullah等[9]用該法測定了藥品中GAH的含量，在0.02～0.18 μg/ml范圍內遵守比爾定律，該法比Elson-Morgan法準確率高70多倍。

1.5 京尼平法

利用京尼平與氨基發生顯色反應，在590 nm波長處測定吸光度。何思蓓等[10]用京尼平顯色測定GAH含量，結果表明GAH含量測定的檢測波長為590 nm，在80 ℃和pH 8～11條件下，反應時間2 h，產物顯色性質穩定，該法與Elson-Morgan法無顯著差別，可用于實驗室簡便測定。

分光光度法是測定GAH的常用方法，該法專屬性強，靈敏度較高，但操作過程復雜，影響顯色的因素較多，重現性較差，操作時注意精密操作以減小誤差。

2 色譜法

色譜法包括高效液相色譜法（HPLC）、氣相色譜法（GC）、高效薄層色譜法（HPTLC）、毛細管電泳法、液質聯用法和離子色譜法6種方法。

試劑：質量分數為75%的甲氨基阿維菌素苯甲酸鹽藥粉(湖北荊洪生物科技股份有限公司生產)，溶劑包括甲醇(AR級，上海潤捷化學試劑有限公司生產)、二甲基甲酰胺(DMF，上海潤捷化學試劑有限公司生產)及醋酸仲丁酯(AR級，上海潤捷化學試劑有限公司生產)，乳化劑包括蓖麻油聚氧乙烯醚(BY-125，邢臺藍天精細化工股份有限公司生產)、苯乙基酚聚氧乙烯醚(600號， 邢臺藍天精細化工股份有限公司生產)、有機硅(自制)和7211(自制)．

2.1 HPLC

2.1.1 不經衍生直接測定

2.1.1.1 HPLC-紫外檢測法 羅立等[11]用HPLC測定了GAH及其制劑，檢測波長為195 nm，氨基柱HPLC普適性、耐用性良好，能將氯離子與GAH完全分離，采用常規的紫外檢測器，可滿足生產企業現有的檢測技術水平。Kosman等[12]采用HPLC，檢測波長為 195 nm，考察了在水及不同pH（1.2，4.5和6.8）溶出介質中GAH硫酸軟骨素復方片的溶出度。

2.1.1.2 HPLC-二極管陣列檢測法 張潔等[13]采用反相高效液相色譜（RP-HPLC）測定GAH。采用二極管陣列檢測器，利用親水作用較強的色譜柱，避免目標峰周圍出現負峰、與雜質峰分離不好和目標物不保留的問題。沈丹丹等[14]采用Phenomenex Luna NH2色譜柱，以磷酸鹽緩沖液-乙腈（25:75）為流動相，流速為1.5 ml/min，柱溫30 ℃，檢測波長195 nm，測定了不同廠家GAH制劑的含量及有關物質。

2.1.1.3 HPLC-蒸發光檢測法 宮艷艷等[15]應用HPLC-蒸發光法，測定了保健品中GAH的含量，采用Waters Xbridge Amide柱，蒸發光散射檢測器，檢測條件為漂移管溫度105 ℃，載氣N2，壓力12.5 bar。王太亮等[16]采用HPLC-蒸發光散射檢測法測定了氨糖美辛腸溶膠囊中GAH的含量，采用Inertsil C8色譜柱，以乙腈-水（70:30）為流動相，流速為1.0 ml/min，柱溫為25 ℃。楊淮等[17]采用HPLC-蒸發光散射檢測法測定了GAH膠囊的含量，使用氨基色譜柱，以乙腈-水（70:30）為流動相，流速為1.0 ml/min。

2.1.1.4 HPLC-示差折光檢測法 姜紅等[18]用HPLC-示差折光法測定GAH含量，采用NH2色譜柱，以磷酸銨緩沖液-乙腈（45:55）為流動相，流速為0.6 ml/min，為質量標準提高提供參考，適合于GAH類藥物的質量控制。

2.1.2 衍生后測定 朱志靈等[19]采用RP-HPLC柱前衍生化法測定殼聚糖噴霧劑中GAH的含量，采用Kromasil C18色譜柱，以乙腈-0.05 %磷酸鹽緩沖液為流動相，梯度洗脫，流速為0.6 ml/min，衍生化后產生的兩個異構體均達到良好分離。王英瑛等[20]將芴甲氧羰酰琥珀酰亞胺（FMOC-OSu）加入GAH溶液，在三乙胺存在的堿性條件下進行衍生化反應，衍生后用HPLC在265 nm波長處測定。采用該法測定了原料藥、片劑及氨基葡萄糖硫酸鈉鹽膠囊中GAH含量。Zhu等[21]采用氯甲酸芴甲酯（FMOCCl）對幾丁質水解產生的GAH進行衍生化后，用HPLC在254 nm波長處測定了GAH含量，該法還可用于測定原料及食品中幾丁質的純度。王德偉等[22]用RP-HPLC柱前在線衍生法在340 nm波長處測定了保健品中氨基葡萄糖硫酸鉀鹽的含量，利用鄰苯二甲醛衍生試劑與氨基葡萄糖硫酸鉀鹽中的氨基進行柱前在線衍生化反應，解決了GAH在反相柱上保留時間短，難與雜質分離的缺點。

2.2 GC

李俊等[23]以1-甲基咪唑為溶劑和催化劑，以鹽酸羥胺和乙酸酐為肟化和乙酰化試劑，對GAH片進行衍生化，以甘露醇為內標，用衍生化GC測定了GAH的含量。

2.3 HPTLC

Sullivan等[24]將GAH在硅膠板上展開，噴茚三酮后置可見燈下檢視，測定了營養品中GAH含量。Esters等[25]將樣品在F254硅膠薄層板上展開后，浸入改良香草醛試液中，加熱后顯棕紅色斑點，在415 nm波長處測定了含中草藥成分的營養品中GAH含量。

2.4 毛細管電泳法

Qi 等[26]用毛細管電泳法將GAH、氨基半乳糖、N-甲基葡糖胺、N-乙酰氨基葡糖及氨基葡萄糖醛酸等氨基糖分離。分離后的氨基糖經微波消解丹酰化后在214 nm波長處進行在線紫外吸收檢測。張佳蕊等[27]建立了毛細管電泳間接紫外檢測法測定GAH的含量，背景電解質溶液為60 mmol/L吡啶二羧酸-0.3 mmol/L十六烷基三甲基溴化銨，pH值為12.30。

2.5 液質聯用法

張華珺等[28]建立了高效液相色譜-質譜聯用法（HPLC-MS）測定GAH的含量，優化液相色譜條件，選擇CAPCELL PAK CR 1:4色譜柱，流動相為乙腈-20 mmol/L乙酸銨溶液（含0.1 %醋酸）=1:1，流速為0.3 ml/min，采用正離子檢測，選擇反應監測模式進行定性定量。李鵬飛等[29]采用LC-MS/MS測定人血漿中GAH的濃度，色譜柱選用Agilent TCC18，流動相為乙腈-0.01 %氨水，梯度洗脫，多反應監測模式檢測。Roda 等[30]將血漿用三氯乙酸沉淀蛋白后，用高效液相色譜-電噴霧離子化質譜聯用法（HPLC-ESI-MS）間接測定了人血漿中GAH含量，使用聚合物基質氨基高效液相色譜柱和水-乙腈流動相梯度洗脫，用MS進行檢測，使用電噴霧源并采用多反應監測，分別監測葡萄糖胺和內標物。Zhong等[31]也用HPLC-ESI-MS法測定了人血漿中GAH含量，將血漿蛋白質沉淀后，在Inertsil CN-3色譜柱上等度洗脫，采用MS，多反應監測模式下檢測，m/z為180/72，將分析時間大大縮短，提高了工作效率。

2.6 離子色譜法

豐航等[32]利用GAH和維生素C的電導性質，采用離子色譜法對其進行分離，借助電導檢測器同時進行二者的含量測定。戰英等[33]用陰離子色譜法測定了保健食品中的GAH，該法操作簡單，靈敏度高，專屬性強，準確度及重復性良好，但是測定時色譜柱易受有機物污染，色譜柱耐受性差，可為該產品的質量控制提供參考。

GAH無特征吸收，HPLC直接測定時采用末端吸收處波長或特殊色譜柱，受流動相、儀器穩定性、色譜柱填料穩定性等因素影響較大；采用HPLC-蒸發光檢測法、HPLC-示差折光檢測法時方法簡便、準確、專屬性強；采用衍生后HPLC測定，有特征吸收，準確度高，但是衍生操作較繁瑣；衍生化GC專屬性較好，但衍生化操作步驟繁瑣；薄層色譜法及毛細管電泳法操作步驟均較多，影響因素多，操作重復性較差；液質聯用法快速、靈敏、高效，適用于低濃度樣品的測定。

3 旋光度法

GAH具有光學活性，平面偏振光通過其溶液時，能引起旋光現象，使偏振光的平面向左或向右旋轉，即為旋光度。可利用這一性質測定GAH的含量。莊旭琴[34]采用旋光度法測定了GAH片的含量，濃度與旋光度之間有良好線性關系，回收率好。旋光度法靈敏、準確、操作簡單，但對溫度要求高，需要在特定溫度下操作。

4 滴定法

將D-GAH溶于75 %乙醇溶液中，以麝香草酚蘭為指示劑，用乙醇鉀溶液滴定至終點時，溶液呈亮藍色，根據乙醇鉀消耗體積，計算GAH的含量。陳金東等[35]用該法測定了保健食品中GAH的含量。駱治瓊[36]用滴定分析法和分光光度法測定保健食品中D-GAH的含量，對于兩種方法的回收率、精密度及檢測結果進行對比，結果無顯著差異，且能實現自動化檢測。滴定法簡便、快捷，適于含量較高的樣品中GAH的測定測定，使用自動電位滴定儀重復性更好。

5 結語

GAH及其制劑在多個領域得到了廣泛應用，其含量測定方法有多種。隨著新方法新技術的產生，基于不同的測定原理，GAH的含量測定方法越來越多樣，選擇GAH含量測定方法時應根據樣品的具體特點選擇合適的測定方法。