某綜合醫院重癥監護病房耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌環境流行調查

史慶豐，黃英男，孫 偉，崔揚文，胡必杰,，高曉東

(復旦大學附屬中山醫院 1. 感染管理科； 2. 感染科，上海 200032)

肺炎克雷伯菌是一種可以導致社區獲得性感染和醫院感染的常見致病菌，可無癥狀定植于正常人群呼吸道和腸道，并可廣泛分布于水生環境中，尤其以醫院重癥監護病房(intensive care unit, ICU)分離和報道最為多見[1]。近年來，隨著碳青霉烯類抗生素的廣泛使用，我國住院患者送檢標本中耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌(carbapenem-resistantKlebsiellapneumoniae, CRKP)的分離率呈上升趨勢[2]，其感染可造成26%～44%的歸因死亡[3]。ICU環境物體表面以及診療設備作為醫務人員手最頻繁接觸的地方，也是多重耐藥菌最容易定植和傳播的關鍵場所。本次研究對某綜合醫院多個外科ICU進行環境采樣，分析ICU CRKP污染現狀并初步探討其環境流行的特點。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 mSuper CARBA顯色培養基(江蘇科馬嘉微生物技術有限公司)，滅菌棉簽，無菌PBS緩沖液，MALDI-TOF質譜儀，PCR Master Mix試劑盒(美國Thermo公司)，D2000 DNA marker(北京天根生化科技有限公司)，PCR儀(美國Bio-rad公司)，電泳儀(美國Bio-rad公司)。

1.2 采樣地點 選取某三級綜合醫院5個外科ICU(急診ICU、心外ICU、肝外ICU、大外科ICU、外科ICU A)進行環境采樣，所有ICU采樣點均在近期檢出過CRKP患者的病床周圍。采樣前未通知相關科室，采樣時間為工作日10:00左右，所采病區均已完成當日常規環境清潔消毒。

1.3 采樣方法 使用浸有PBS的無菌棉簽，對以下地點進行采樣：①選取床欄、呼吸機面板、聽診器、枕頭等醫務人員床旁高頻接觸的物體表面；②治療桌表面、手持機表面，病房公用電腦鍵盤、藥品存儲柜的把手、治療車把手；③選取洗手池壁、排水孔，治療室洗手池壁、排水孔，污物間拖把清洗池壁、排水孔，污物排放池壁、排水孔；④護理CRKP定植/感染患者的護工工作服領口、袖口、口袋口等。按照《醫院消毒衛生標準》[4]要求進行采樣：規則或平整表面使用棉簽采集面積5 cm×5 cm的區域，不規則或不平整的物體表面使用無菌棉簽直接涂抹采樣。將采樣好的棉拭子放置于含有中和劑的試管中保存并轉移。將已采樣的棉拭子在mSuper CARBA顯色培養基平血上反復均勻涂抹5次將平血置37℃恒溫箱培養48 h。

1.4 碳青霉烯酶鑒定 根據顯色培養基說明書，挑取金屬藍色、深藍色的細菌菌落使用MALDI-TOF質譜儀進行菌種鑒定。使用雙紙片協同法聯合EDTA-Na2對過夜培養的細菌進行碳青霉烯酶表型鑒定。

1.5 DNA提取 使用接種環挑取碳青霉烯酶表型陽性的4～5個純菌落轉至1.5 mL EP管中，加入1 mL無菌雙蒸水，震蕩混勻后懸于100℃加熱儀中裂解30 min。取出離心管，13 000 r/min離心10 min，取上清液分裝于新EP管中，作為PCR試驗細菌DNA模板。

1.6 產碳青霉烯酶基因的檢測 KPC和NDM引物序列見表1[5]，由上海生工生物技術公司合成。選用含KPC耐藥基因的肺炎克雷伯菌ATCC 1705作為KPC陽性對照，不含KPC耐藥基因的肺炎克雷伯菌ATCC 1706作為陰性對照。臨床分離且NDM耐藥基因陽性的肺炎克雷伯菌株作為NDM陽性對照，臨床分離且NDM鑒定陰性的肺炎克雷伯菌株作為陰性對照。PCR反應體系上下游引物各1 μL，DNA模版2 μL，雙蒸水21 μL。擴增條件均為：94℃預變性5 min，94℃變性45 s，55℃退火45 s，72℃延伸1 min，共計35個循環，最后72℃循環10 min。將PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳，電壓為100 V，電泳30 min后在凝膠成像系統上閱讀結果。

表1 碳青霉烯酶耐藥基因引物序列和產物大小

2 結果

2.1 采樣結果

2.1.1 床旁高頻接觸物表采樣結果 床旁共計采樣73份，其中床欄27份，聽診器9份，呼吸機面板28份，枕頭9份。心外ICU床欄處分離1株CRKP，其余采樣點均未分離到CRKP菌株。見表2。

表2 床旁高頻接觸物體表面CRKP檢出情況(陽性標本數/采樣標本數)

2.1.2 公共區域采樣結果 公共區域共計采樣89份，其中治療桌33份，手持機29份，電腦鍵盤11份，儲物柜把手9份，治療車把手7分。外科ICU A某床手持機分離到1株CRKP，其余采樣點未分離到CRKP。見表3。

表3 公共區域環境CRKP檢出情況(陽性標本數/采樣標本數)

2.1.3 水池采樣結果 ICU水池共計采樣59份，其中30份分離出CRKP。主要分離于洗手池孔、治療室水池孔、污物傾倒池壁和池孔。見表4。

表4 ICU水池CRKP檢出情況(陽性標本數/采樣標本數)

2.1.4 護工衣物采樣結果 對CRKP定植/感染患者護理的8名護工進行采樣，1名肝外ICU護工袖口處分離到CRKP，其余采樣點未分離到CRKP。見表5。

表5 護工衣物CRKP檢出情況(陽性標本數/采樣標本數)

2.2 碳青霉烯酶表型鑒定結果 碳青霉烯酶表型鑒定結果顯示，28株CRKP中5株產A類酶，11株產B類金屬酶。見表6。其中心外ICU床欄分離的1株CRKP以及水池孔分離的2株CRKP同時產A類酶和B類酶。

表6 28株CRKP碳青霉烯酶表型鑒定結果

2.3 碳青霉烯酶耐藥基因鑒定結果 PCR檢測結果顯示，2株CRKP攜帶KPC型耐藥基因，3株CRKP攜帶NDM型耐藥基因。其中心外ICU床欄分離的CRKP同時攜帶KPC和NDM耐藥基因。見圖1。

注：M為DL 2000 DNA Marker; Marker左側為KPC耐藥基因PCR結果，其中1泳道標本來自心外ICU床欄分離標本，2泳道標本來自肝外ICU護工袖口，3～5號來自水池孔標本，6號為KPC陰性對照(肺炎克雷伯菌ATCC 1706)，7號為KPC陽性對照(肺炎克雷伯菌ATCC 1705)。Marker右側號為NDM耐藥基因PCR結果，其中1號泳道標本來自心外ICU床欄分離標本，5號標本分離自外科ICU A手持機，12號為NDM陰性對照，13號為NDM陽性對照標本，剩余樣本分離自ICU洗手池。

3 討論

近年來，CRKP呈現全球廣泛流行的趨勢，正常人可通過食物攝取使其在胃腸道無癥狀定植[6-8]。國外研究已證實，50%耐碳青霉烯類腸桿菌(carbapenem-resistant Enterobacteria，CRE)定植患者可在住院30 d內發展為CRE感染，其感染風險是非定植患者的10.8倍。然而同源分析顯示，其中僅1例患者的腸道定植菌與感染菌同種同源，提示醫務人員和ICU周邊環境在CRE傳播中起到關鍵作用[9]。國內外多項研究指出，CRKP在ICU暴發或流行期間，加強醫務人員手衛生、環境清潔和消毒以及進行隔離可有效降低相關感染的發生[10-11]，但研究多聚焦于醫院感染預防措施和臨床結局，對相關環境污染的調查較為少見。盡管國內相關規范和醫院標準操作流程已對環境清潔和消毒的頻次、消毒劑的濃度以及擦拭順序進行了詳盡的指導，但仍無法杜絕CRKP在ICU的流行，提示日常環境清潔和消毒可能存在盲點。

本研究使用mSuper CARBA顯色培養基進行環境CRKP篩查，該培養基含有碳青霉烯類抗生素，可有效抑制對β-內酰胺酶敏感，產ESBLs、Ampc酶細菌的生長，CRKP菌株在接種24 h后會顯示金屬藍色或深藍色。經MALDI-TOF質譜儀進行菌種鑒定后，可較為準確識別環境中的CRKP。本次采樣未能在CRKP患者床單元的高頻接觸物體表面，如床欄、呼吸機面板、聽診器、患者使用的枕頭分離到CRKP，同時公共區域內的高頻接觸物體表面，如治療桌面、手持機、電腦鍵盤、存儲柜把手以及治療車把手上也未能分離到CRKP，與廖睿純等[12]的研究結論類似，可能與本次采樣前各ICU病區已完成常規環境清潔和消毒，且工勤人員執行情況較好有關。

研究證實水龍頭可被大量奧斯陸莫拉菌污染，并伴隨噴濺的水污染周圍直徑約70 cm的區域[13]。水龍頭水直接流向水槽排水管或水槽內表面的沖擊力會導致細菌擴散，對水龍頭上方10 cm處的空氣采樣發現銅綠假單胞菌，達439 CFU/m3，或成為ICU潛在致病源[14]。水槽的深度可能是細菌傳播的關鍵因素，水槽深度>19 cm時細菌噴濺污染概率將大大增高[15]。本次采樣的5個洗手池與患者病床存在2～5 m的物理間距，但CRKP仍在洗手池孔、治療室水池孔、污物傾倒池壁和池孔大量定植。ICU洗手池除進行手衛生外，偶爾還存在傾倒患者體液，沖洗患者使用過的儀器或器具等不當行為，可能是多重耐藥菌在水槽中廣泛定植的主要原因。盡管近5年的醫院監測結果顯示，5個外科ICU未曾發生CRKP感染暴發事件，但有文獻報道顯示，由水槽所引起的CRE感染暴發平均持續時間為37個月，病例之間平均間隔可長達10.2個月，引起暴發的水槽存在清潔和消毒困難等問題[16]，更換水槽或管道后暴發終止[17-19]，給醫院感染的識別帶來巨大的挑戰。

產KPC酶和/或產NDM酶是我國25省市CRKP臨床分離株的主要耐藥機制，且2個耐藥基因攜帶率分別高達74%和17%，部分菌株同時攜帶有2種耐藥基因[20]。本研究結果顯示，水池分離的CRKP和高頻接觸的環境表面分離的CRKP菌株特征差異較大。研究[21]顯示，ICU管道污水和外部檢修孔采集的所有標本均含有產碳青霉烯酶的微生物，雖然環境中采集到的CRE與患者標本中采集的CRE在細菌種屬類別和藥物敏感性上均存在差異，但兩者存在密切的質粒交換，考慮可能CRE主要在排水管中發生接合和重組，繼而通過環境清潔和醫務人員手衛生等行為導致住院患者發生感染，所以仍值得警惕和進一步研究。

本研究存在以下的局限：①未能對ICU所有可能污染的區域進行長期的、系統的采樣，對了解CRKP環境動態分布和傳播存在一定盲點；②僅重點關注CRKP的環境污染現狀，對醫務人員的手、衣物以及個人用品未進行采樣分析，對醫務人員在CRKP傳播中的媒介作用未能很好的分析；③受限于研究經費和時間的影響，本研究尚未完成環境與臨床分離CRKP的同源性鑒定，因而未能明確護工袖口處分離的CRKP是否來源于所護理的患者，無法推測CRKP感染路徑。