濾膜法與涂抹法檢測血液透析相關用水微生物的效果

李占結，張 翔，張永祥，趙 旭，2，劉 波，陳文森，張衛紅，李松琴

(1. 南京醫科大學第一附屬醫院感染管理處，江蘇 南京 210029； 2. 蘇州大學附屬兒童醫院感染管理處，江蘇 蘇州 215000； 3. 南京醫科大學附屬江蘇盛澤醫院院長辦公室，江蘇 蘇州 215228)

血液透析治療是終末期腎病的主要替代治療方法之一[1]，血液透析患者由于機體免疫力明顯下降，營養不良，長期接受各種侵入性操作治療等諸多因素，是發生醫院感染的高危人群[2-3]。1例每周接受3次血液透析治療的患者，每次大約接觸150 L透析液，每年接觸23 400 L透析液[4]。細菌學指標是評價透析用水處理工藝運行效果的重要參數，對控制血液透析患者的醫院感染及炎癥等熱原反應有重要意義[5]，是保證血液透析安全的重要保障[6]。對于培養方法，我國于2017年1月1日起實施的YY0572—2015《血液透析及相關治療用水》[7]標準建議選用R2A營養瓊脂或胰化蛋白胨葡萄糖瓊脂(TGEA)，并規定了低溫長時間培養(17～23℃培養168 h)，且首選薄膜過濾法。調研[8]發現，只有極少部分醫療機構將濾膜法應用到血液透析相關用水檢測中。考慮主要原因可能是大多醫療機構對濾膜法相對比較陌生，且其在血液透析用水檢測上的效果如何，并無明確依據。國內外對于血液透析相關用水微生物培養的相關研究并不少見，但大部分研究[1，9-12]都聚焦在比較不同培養基,分別在相應的溫度和時間條件下進行培養的結果對比，分析最佳的培養基、培養溫度和培養時間，而對于不同接種方法的效果研究比較少見。某三甲綜合醫院擁有近百張血液透析機，并于2017年便啟用了濾膜法和涂抹法同時接種血液透析相關用水，日常監測工作可獲得大量數據，本研究結合實際工作中的相關監測數據，回顧性分析比較濾膜法和涂抹檢測血液透析相關用水微生物的效果，以期為其他醫療機構提供參考和借鑒。

1 資料與方法

1.1 資料來源 根據年度采樣安排按順序選取某大型三甲綜合醫院2018年1—12月血液凈化中心的血液透析相關用水微生物檢測，全年覆蓋該醫院所有透析機器。納入同時使用薄膜過濾法(簡稱濾膜法)和平板涂布法(簡稱涂抹法)檢測的標本。排除僅使用濾膜法或涂抹法其中一種方法檢測的結果及受到污染的檢測結果。回顧性分析對比濾膜法和涂抹法檢測血液透析相關用水微生物的效果。

1.2 研究方法

1.2.1 數據收集 將血液透析相關用水分為透析液、反滲水、B液、置換液、其他透析用水(包括進水口、出水口、回水末端)5類，分別統計使用濾膜法和涂抹法檢測血液透析相關用水細菌檢出率、單位菌落數、超干預值檢出率和微生物合格率，并進行對比分析。

1.2.2 采樣方法 根據《血液透析和相關治療用水(YY 0572—2015)》[7]，以及《血液凈化標準操作規程(SOP)(2020版征求意見稿)》[13]要求，保持并開啟標本取樣口放水60 s后，使用75%乙醇消毒擦拭出水口外表面3次，待乙醇完全揮發后方進行采樣。對于進水口、出水口及回水末端(本院的血液凈化中心為集中供水模式)使用100 mL無菌藍口瓶采樣50 mL并送檢，對于透析液、反滲水、B液、置換液使用無菌試管采樣5 mL并送檢。透析用水采樣位點見圖1。

圖1 透析用水采樣位點選擇示意圖

1.2.3 接種培養方法 標本采集后均于4 h內接種。涂抹法：將樣本充分混勻，從標本中取0.5 mL勻液涂抹于R2A營養瓊脂培養基(青島海博生物技術有限公司)；濾膜法：剩余部分使用六聯抽濾系統(津市津騰實驗設備有限公司)接種于R2A營養瓊脂培養基，每組六聯濾膜法接種的標本均同時增加陰性對照(5個正常檢測、1個陰性對照)。將接種標本的培養基置于23℃培養箱中培養7 d后統計結果。

1.2.4 合格標準 根據《血液透析和相關治療用水》(YY 0572—2015)[7]，以及《血液凈化標準操作規程(2020版征求意見稿)》[13]要求，微生物合格標準：透析用水(包括反滲水、入水口、出水口、回水末端)、透析液、B液≤100 CFU/mL，置換液要求無菌。超干預值標準：透析用水(包括反滲水、入水口、出水口、回水末端)、透析液>50 CFU/mL，B液及置換液無超干預值要求。

1.3 相關指標計算方法 以檢出結果≥1 CFU/mL計為菌落檢出，菌落檢出率=菌落檢出的標本數量/所有同類標本數量×100%；單位菌落數即每mL標本檢出菌落數(CFU)；超干預值標本檢出率=超干預值標本份數/所有同類標本份數×100%；微生物合格率=合格標本份數/所有同類標本份數×100%。

2 結果

2.1 細菌檢出情況 共納入血液透析相關用水標本274份，其中透析液131份，反滲水39份，B濃縮液(下簡稱B液)14份，置換液34份，其他透析用水56份(包括進水口20份，出水口18份，回水末端18份)。在透析液、反滲水、B液、置換液以及其他透析用水的微生物檢測中，濾膜法的細菌檢出率均高于涂抹法，其中透析液、反滲水、置換液、其他透析用水標本使用兩種方法的細菌檢出率比較，差異有統計學意義(均P<0.05)。見表1。

表1 血液透析相關用水兩種方法細菌檢出情況

2.2 單位菌落數檢測結果 反滲水、置換液標本單位菌落數濾膜法數值高于涂抹法，透析液、B液、其他透析用水標本單位菌落數濾膜法數值低于涂抹法，但僅其他透析用水標本使用兩種方法檢測結果單位菌落數差異有統計學意義(t=-3.011，P=0.004)。見圖2。

圖2 血液透析相關用水單位菌落數兩種方法檢測結果對比圖

2.3 超干預值檢測結果 置換液和B液不存在超干預值，本組統計數據排除置換液(34份)和B液(14份)，納入標本226份。透析液和反滲水使用兩種方法檢測的超干預值檢出率均相同，其他透析用水中濾膜法低于涂抹法，差異有統計學意義(χ2=6.596，P=0.010)。見表2。

表2 血液透析相關用水超干預值兩種方法檢測結果

2.4 微生物合格情況 透析液、B液、其他透析用水標本使用兩種方法檢測微生物合格率，濾膜法數值上高于涂抹法，置換液、反滲水標本檢測微生物合格率，濾膜法數值上低于涂抹法，但僅置換液標本檢測微生物合格率差異有統計學意義(χ2=18.987，P<0.001)，其余差異均無統計學意義(均P>0.05)。見表3。

表3 血液透析相關用水兩種方法檢測微生物合格情況

3 討論

本研究依據行業標準規定的方法，使用R2A瓊脂培養基在23℃培養168 h，且此方法已經得到諸多循證研究證據的支持。在此條件下對濾膜法和涂抹法微生物的檢測效果比較，具有更大的科學性和參考價值。

研究結果顯示，使用濾膜法對血液透析相關用水進行微生物檢測，細菌檢出率高于涂抹法，與寧培勇等[8]研究結果一致，但其研究采樣對象為天津市多個醫療機構的透析用水，且培養是使用胰化蛋白胨葡萄糖培養基(TGEA)20℃培養168 h，結果顯示濾膜法和涂抹法細菌檢出率分別為63.51%、62.16%，而本研究中透析用水(包括反滲水和其他透析用水)濾膜法和涂抹法細菌檢出率分別為74.74%、45.26%。考慮主要原因可能為其采樣方式為抽檢采樣，而本研究中的采樣為全年每月規律采樣的全部結果，更穩定且更符合實際情況，也更反映濾膜法檢出細菌的能力高于涂抹法。甘良英等[14]采集透析用水和透析液，在胰化蛋白胨葡萄糖培養基(TGEA)上20℃培養168 h，結果顯示單位菌落數濾膜法為2.7(0.05，23.50)CFU/mL，涂抹法為2.8(0.60，24.75)CFU/mL，兩者比較差異無統計學意義。本研究中單位菌落數其他透析用水檢測結果濾膜法[(2.64±4.46)CFU/mL]低于涂抹法[(22.54±51.20)CFU/mL]，且差異有統計學意義(t=-3.011，P=0.004)，而其余血液透析相關用水則差異無統計學意義。與甘良英等[14]研究中的濾膜法均采用1 mL標本進行檢測不同，本研究中其他透析用水均采用49.5 mL標本進行檢測，而濾膜直徑僅5 cm，在如此小的面積中，實際操作中濾膜上細菌超過200 CFU就已無法肉眼計數，導致菌落計數比實際菌落數可能低很多，進而出現了本研究中濾膜法單位菌落數遠低于涂抹法。在超干預值檢出率方面，也是其他透析用水涂抹法(14.29%)高于濾膜法(0)，原因與上述相同，大量標本使用濾膜法進行檢測時，結果計數會出現虛低，導致超干預值檢出率低于實際情況。本研究中，置換液濾膜法合格率低于涂抹法，差異有統計學意義(P<0.001)，分析原因為置換液合格閾值較低(0 CFU/mL)，濾膜法細菌檢測能力更強，更能真實反映置換液微生物情況。其余血液透析相關用水使用兩種方法檢測微生物合格率差異無統計學意義，與相關研究[8,14]結果一致，且濾膜法均高于涂抹法，也與其閾值較高有關(100 CFU/mL)。

本研究發現濾膜法應用于血液透析相關用水檢測本身存在一定的局限性，除了置換液，其余血液透析相關用水的閾值均為100 CFU/mL，標本為50 mL情況下，濾膜上菌落數>5 000 CFU(即使標本為5 mL，也需菌落數>500 CFU)，才能判定其不合格，而濾膜面積較小，無法計數太多菌落，導致可能出現假陰性(合格)的結果。而在閾值較低的標本中，更適合使用濾膜法，如置換液(0 CFU/mL)、內鏡(≤20 CFU/件)[15]。

綜上所述，濾膜法檢出細菌的能力高于涂抹法，但其在血液透析相關用水微生物檢測中存在一定局限性，除用于置換液比較適合外，應用在其余血液透析相關用水微生物的檢測效果并不優于涂抹法。