植物外泌體提取及應用研究進展

帖慧琳，李春磊，王浩然，于榮敏，朱建華

（暨南大學 藥學院，廣東 廣州 510632）

真核細胞釋放到細胞外空間的小泡稱為胞外囊泡（extracellular vesicles，EV）[1]。 EV在細胞間[2]和種間通訊[3]及免疫反應[4]中起重要作用[5]。到目前為止，已經在真核細胞中發現了3種EV，包括多囊體（multivesicular body，MVB）-質膜（plasma membrane，PM）融合產生的外泌體，從PM直接萌發的微囊泡，以及細胞死亡過程中產生的凋亡小體[6-8]。

外泌體是真核細胞分泌的直徑為40～100 nm的細胞外囊泡，是細胞內MVB與PM融合后從細胞中釋放的小泡[9]。許多哺乳動物細胞有釋放外泌體的能力，包括網織紅細胞、樹突狀細胞、B細胞、T細胞、肥大細胞、上皮細胞、腫瘤細胞等。在動物細胞中發現外泌體后，越來越多的證據表明在植物中會出現MVB和類似外泌體的囊泡。這些發現主要集中在細胞生長和分化（包括與細胞壁相關的過程）研究上，或集中在植物對各種脅迫的反應上[10]。

除了動物體液外，許多植物中也發現含蛋白質和小RNA的外泌體樣納米粒子，如生姜、胡蘿卜、西瓜葡萄、橄欖、瓜子。這些植物外泌體由于缺乏毒性，有大規模生產的可能性，其內在特性和攜帶藥物或小RNA分子等其他化合物的可能性，在醫療應用中引起了廣泛關注[11]。Regente等[12]于2009年首次發現植物中存在外泌體樣小泡，該小泡在向日葵種子中直徑為50～200 nm。其后許多研究集中于囊泡及其生物活性成分的深層表征，以更好地了解其內在特性和可能的生物技術應用。有研究通過超速離心從植物物種，如葡萄、葡萄柚、姜和西蘭花中分離出帶有特定的蛋白質組、脂質組和轉錄組譜的細胞外囊泡[13-16]；并發現這些可食用植物來源的囊泡有抗炎特性：葡萄、葡萄柚來源的外泌體樣納米顆粒有靶向腸道細胞的作用，并能在使小鼠免受硫酸葡聚糖鈉誘導的結腸炎方面發揮作用[13-14]。

1 植物外泌體分泌方式和物質構成

植物外泌體與動物外泌體形態結構類似，有磷脂雙分子層結構，含有蛋白質和微小RNA，呈茶托狀或杯狀，其形態可利用透射電子顯微鏡（TEM）觀察[17]。提取外泌體總脂后，對其進行更詳細分析[18-19]。蛋白質分析表明，包含參與信號傳遞的蛋白質，其中許多蛋白質在應激和免疫反應中被高度誘導；還包含涉及活性氧信號傳導和氧化應激反應的蛋白質，及各種膜轉運蛋白和囊泡內轉運蛋白[20]。植物外泌體含有較豐富的miRNA，其為一類長度約為22個核苷酸的內源單鏈非編碼RNA，在生物體中起重要作用，是一種高效的基因表達調控因子[21]。越來越多報告顯示，miRNA不僅在其原始系統內執行生物學功能，還可進行跨界基因表達調控[22]。

2 植物外泌體的分離純化及鑒定

2.1 植物外泌體的分離純化

目前，外泌體的分離方法主要包括超速離心法[23]、蔗糖密度梯度離心法[24]、超濾離心法[25]、免疫磁珠法[26]、聚合物沉淀法[27]、尺寸排阻色譜法[28]和微流控技術[29]。這些分離方法均有各自的優勢和局限性。超速離心法和蔗糖密度梯度離心法利用外泌體與其他組分在密度和大小上的差異，通過不同的離心力分離外泌體，操作簡單、獲得的外泌體數量較多，但工藝費時、回收率不穩定，反復離心可能會對外泌體造成損傷[23-24]。超濾離心法是基于粒子大小的分離技術，利用超濾膜將外泌體從蛋白質等生物大分子中分離，不影響外泌體的生物活性，但可能損傷外泌體，不能保持其形態[25]。免疫磁珠法是基于外泌體表面的受體對其進行分離，能分離所有外泌體或外泌體的選擇性亞型，但這種方法成本高，使用條件苛刻，不適于大量樣品，且此方法分離的囊泡可能失去原有的功能活性[26]。聚合物沉淀法利用聚合物（如聚乙二醇）劫持水分子，使外泌體溶解度下降，再通過低速離心分離，操作簡單、無需專門設備，目前已實現商品化，但提取過程中脂蛋白和聚合物之間可能產生沉淀，導致外泌體純度降低[27]。尺寸排阻色譜法是基于分離分子的大小和尺寸進行分離，分離純度高、可保證外泌體的完整性和生物活性，但提取的外泌體濃度低，后續應用需濃縮，且需專業設備[28]。近年，新發展的微流控技術是一種基于外泌體生物化學和物理性質差異的微尺度分離技術，樣品處理速度快、成本低、靈敏度高，但產量較低，僅適用于診斷[29]；還有試劑盒提取外泌體，此法操作簡單便捷，不需特殊設備，隨著產品不斷更新換代，提取效率和純化效果逐漸提高，但市場上各類產品分離純化效果良莠不齊[30]。

目前，大多用超速離心法和蔗糖密度梯度離心法提取植物外泌體。Regente等[12]最早從向日葵種子中提取細胞外囊泡。將20g種子中提取的細胞外液通過0.5 μm膜過濾，并通過連續離心步驟分別按照步驟10 000g離心30 min，40 000g離心60 min和100 000g離心60 min分級分離。棄去第一個沉淀，將40 000g和100 000g沉淀部分分別重懸在Tris-HCl pH 7.5緩沖液中。結果在40 000g部分有較高密度50～200 nm 囊泡樣小泡。Brian等[20]提取擬南芥葉片的細胞外囊泡，將上述方法40 000g離心部分在OptiPrep密度梯度中純化。Wang等[14]分離柚子的細胞外囊泡，去除果皮，將果肉在高速混合器中于4 ℃下均化1 min。依次將收集的汁液以20 000g離心20 min，然后以10 000g離心1 h除去碎屑。將納米囊泡以150 000g沉淀1.5 h，用磷酸緩沖鹽溶液（PBS）洗滌1次，然后使用蔗糖梯度（分別為8 %，30 %，45 %和60 %）純化和分離。

綜上，植物外泌體的提取方法一般是將待提取部位處理后，先低速離心除去雜質，再高速離心分離外泌體，然后使用密度梯度純化。根據提取的植物種類、部位及作用目的不同在實驗中對提取方法進行調整。

2.2 植物外泌體的鑒定

可使用納米顆粒跟蹤分析儀（NanoSight）平臺、BCA比色法或Bio-Rad蛋白質定量測定試劑盒[17]，通過比較納米囊泡計數與蛋白質濃度的比值估算囊泡制劑的純度；使用電子顯微鏡檢查，觀察到外泌體的杯狀圓形結構，動態光散射分析其粒徑大小約為40～100 nm；流式細胞分析（FACS）進一步證實了所研究囊泡的同源性；采用液相色譜-串聯質譜（LC-MS/MS）技術對外泌體進行廣泛的蛋白質分析，將其與已知的植物外泌體蛋白質進行比對分析[31]。

目前，對植物外泌體的鑒定主要是采用電子顯微鏡觀察形態和動態光散射分析粒徑分布。動物外泌體已有標記蛋白可確定，但植物外泌體在這方面的研究還不成熟。

3 外泌體的功能及應用

3.1 對腸道菌群的作用

飲食已被證明對人腸道菌群的組成有相當大的影響[32]。Yun等[33]研究了植物來源外泌體中RNA對腸道菌群的作用，從生姜外泌體中鑒定出小RNA和miRNA，可調節腸道微生物組成及其代謝產物，并抑制小鼠結腸炎。主要機制：（1）富含脂質的ELN生姜外泌體發出一個信號，導致腸道細菌對其進行吸收；（2）外泌體的小RNA介導腸道微生物和宿主免疫系統之間的相互作用，形成免疫和腸道微生物之間的平衡；（3）外泌體RNA調節腸道微生物的組成、代謝產物、生長和定位。具體是生姜外泌體中RNA誘導的腸道益生菌LGGI3A通過激活AHR信號通路促進IL-22表達，在屏障表面誘導抗微生物免疫和組織修復。此前，其他研究也發現生姜類外泌體納米粒子可降低炎性細胞因子[腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白介素6（IL-6）和IL-1β）]表達，增加結腸炎模型中的抗炎細胞因子（IL-10和IL-22）的表達[34]。

3.2 種間通訊

Mu等[17]從葡萄、葡萄柚、生姜、胡蘿卜4種食用植物中分離和鑒定了外泌體，證實了這些細胞外囊泡大小和結構與哺乳動物的外泌體相似。這些植物外泌體被腸道巨噬細胞和干細胞吸收，并對受體細胞有生物學效應。其中，生姜外泌體誘導巨噬細胞內血紅素加氧酶-1（HO-1）和IL-10表達；而包括葡萄和葡萄柚在內的果源外泌體誘導Wnt/TCF4活化，Wnt信號是維持腸內穩態的關鍵。研究表明，植物通過類外泌體納米顆粒，與哺乳動物細胞（特別是腸道巨噬細胞和干細胞）交流，且不同類型植物的外泌體對受體哺乳動物細胞有不同的生物學效應。

Rutter等[20]從擬南芥玫瑰花的質外體液中純化了囊泡。這些囊泡富含與應激和防御相關的蛋白質，在感染細菌性病原體丁香假單胞菌的強毒株入侵期間和響應水楊酸（SA）的過程中，囊泡分泌增強。數據表明，外泌體有助于先天免疫，并可能介導植物和動物體內的細胞間通訊。Zhao等[35]研究椰汁miRNA和外泌體發現，椰子分離的納米粒子粒徑小于從牛奶中提取的外泌體。這些植物衍生的納米粒子可能與動物衍生的外泌體相似，因此，植物衍生的miRNA有很大的潛力可通過外泌體被吸收到哺乳動物體內。Baldini等[36]在柑橘外泌體樣納米粒子的抗氧化研究中，根據其研究結果推測水果衍生納米粒子在進食后有可能介導物種間的通訊。

3.3 植物防御

外泌體在病原體侵襲期間在植物細胞中增殖，且常在MVB與PM融合的各種狀態下可見。大多數融合發生在乳頭狀結構或細胞外防御結構附近，這些結構能阻止病原體進入細胞[37-38]。促進MVB與PM融合的GTPase酶也積聚在感染部位附近，是成功形成乳頭狀細胞所必需的[39-40]。此外，TEM顯示，乳頭狀基質含有MVB與PM融合后產生的外泌體[41]。Nielsen等[39]在研究白粉病真菌對擬南芥入侵的過程中也發現了多囊泡聚集，病原體入侵會導致植物細胞多囊泡與質膜融合分泌外泌體。這些數據表明植物中外泌體的分泌有助于對病原體的早期防御結構發展。

外來體也可介導小干擾RNA從植物細胞到真菌細胞的運輸。在宿主誘導的基因沉默過程中，在植物（特別是厚樸）中表達的小RNA能減少入侵真菌中目標轉錄物的表達[42]。

3.4 儲存和運輸

采摘被子植物和裸子植物，如樺樹、云杉和楊樹的莖和枝條，液氮低溫機械破壞，對樣本進行掃描電子、原子力顯微鏡、內切葡聚糖酶活性測定等。研究表明，被子植物和裸子植物次生韌皮部和次生木質部的外泌體在內源葡聚糖酶的儲存和運輸中有生理作用[43]。

3.5 藥物載體

外泌體相比較傳統納米載體系統，生物相容性好、利用度高且安全無毒，并能成功攜帶模型藥物和目的基因進一步應用于各種疾病的藥物遞送系統研究[30]。目前動物外泌體裝載化學藥物、核酸藥物及植物提取物的研究已有報道。外泌體有強大的穿透能力，可穿透體內屏障，在體內的穩定性較好，具有脂質雙分子層膜結構，能包裹疏水性藥物，將藥物運送到達受體細胞。有研究表明，由于外泌體體積較小，能避免被單核吞噬細胞系統清除，延長藥物在體內的半衰期[44]。

研究表明[45]通過植物外泌體可將疏水性的姜黃素傳遞到結腸腫瘤和正常結腸組織中，外泌體可被作為細胞處理致癌miRNA的載體。Wang等將葡萄柚產生的細胞外納米囊泡裝載甲氨蝶呤（methotrexate，MTX）遞送給小鼠，能顯著降低MTX毒性，并提高其在硫酸葡聚糖鈉誘導的小鼠結腸炎中的治療作用[14]。

3.6 治療炎癥性腸病

Wang等[14]證明了葡萄柚衍生的納米囊泡被腸道巨噬細胞選擇性吸收，并改善了葡聚糖硫酸鈉誘導的小鼠結腸炎。這些作用是通過上調血紅素加氧酶-1（HO-1）的表達并抑制腸道巨噬細胞中IL-1β和TNF-α的產生而介導的。

一些研究表明，含有姜黃素的外泌體對乳腺癌和大腸癌等多種癌細胞有治療作用[46]。包裹姜黃素的葡萄柚外泌體可改善結腸炎，增加小鼠存活率，減少糞便中的血液，減少體重下降，減少結腸組織中白細胞的浸潤。免疫酶聯分析（ELISA）表明，包裹姜黃素的葡萄柚外泌體對葡聚糖硫酸鈉誘導的結腸炎小鼠結腸組織提取液中TNF-α、IL-6和IL-1b的降低與對照組比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。這種治療策略可用于治療多種炎癥性疾病，包括癌癥和自身免疫性疾病[47]。這些發現表明，外泌體可在腸道中充當免疫調節劑，維持腸道巨噬細胞穩態，并可用于開發口服小分子藥物，減輕疾病中的炎癥反應。

3.7 在癌癥中的作用

Raimondo等[48]研究表明，柑橘檸檬汁中外泌體能通過誘導TRAIL（腫瘤壞死因子α相關凋亡誘導配體）介導的細胞死亡抑制腫瘤細胞生長，而不影響正常細胞，表明食用植物納米小體可能是一種可行的腫瘤治療方法。

4 結論與展望

近年，外泌體已成為生物學、醫藥學等領域的研究熱點，尤其是可食用植物外泌體的研究在不斷增加。目前，外泌體的研究大多集中在動物細胞外泌體，如來源于腫瘤相關巨噬細胞的細胞外泌體，其含有缺氧誘導因子1α（HIF-1α）穩定性lncRNA，可調控乳腺癌的有氧糖酵解[49]；來源于橫紋肌肉瘤的細胞外泌體，對受體橫紋肌肉瘤細胞和成纖維細胞的增殖有積極作用[50]；各種研究均致力于尋找更好的治療策略以解決各種困擾人類已久的腫瘤、癌癥等疑難雜癥，也確實取得了可觀效果。

然而，對植物外泌體的研究還較少。在植物外泌體研究中存在的主要問題有：第一，植物外泌體提取方法較單一，提取工藝優化研究也較少；第二，動物外泌體可通過標記蛋白進行鑒定，但植物外泌體的鑒定中最常用的仍是電鏡觀察和粒徑分析；第三，植物外泌體的研究對象更多是類外泌體納米顆粒，并不完全是外泌體，其范圍較廣泛，如果能進一步優化提取工藝和鑒定方法，植物外泌體的研究會更有說服力。已有的研究表明，植物外泌體在植物防御免疫、種間通訊、治療哺乳動物炎癥反應、作為藥物載體等方面均表現出一定的作用，也表明在這些方面，植物外泌體的發展前景十分廣闊。