人結直腸癌組織CD4+、CD8+ T淋巴細胞與患者預后的關系

傅超，梅婷婷，汪鴻濤，陶勇，王東，裘建明，楊關根

（1.浙江中醫藥大學附屬杭州第三醫院 肛腸外科，浙江 杭州 310009；2.寧波市第一醫院 肛腸外科，浙江 寧波 315000）

結直腸癌是常見的高度惡性的消化道腫瘤之一，在世界范圍內致死率依然居高不下[1]。診斷時常已是中晚期，預后不佳。因此，找到新的腫瘤標志物及時發現預后不良高危患者，一直是研究的熱點與難點。研究證實腫瘤浸潤T淋巴細胞（tumourinfiltrating T lymphocytes，TILs）可改變腫瘤微環境，參與或抑制惡性腫瘤細胞的增殖和遷移[2]。目前發現CD4+、CD8+T淋巴細胞已在肝癌[3]、卵巢癌[4]、胰腺癌[5]、膀胱癌[6]等實體惡性腫瘤存在差異性改變，并可預測其預后，但對于結直腸癌預測研究的報道甚少。因此，本研究探討分析CD4+、CD8+T淋巴細胞水平與結直腸癌患者臨床病理特征及其預后的關系，并評價其作為一項預后標志物的可能性。

1 對象和方法

1.1 對象 入選標準:①所有患者均初次接受標準化結直腸癌手術治療；②術后病理確診為結直腸癌，且根據AJCC第7版TNM分期標準；③未接受其他任何靶向抗腫瘤、新輔助放化療等治療；④排除各種免疫系統疾病如血液病等；⑤排除合并其他惡性腫瘤患者。根據上述標準，收集2012年1月至2014年1月浙江中醫藥大學附屬杭州市第三醫院肛腸科收治的行手術切除并經病理證實的109例結直腸癌患者臨床病理資料及術后標本。其中男71例，女38例，年齡32～78歲。本研究經本院倫理委員會通過，患者或其家屬簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 主要試劑:鼠抗人CD4+單克隆抗體（購自美國Chemicon公司）；鼠抗人CD8+單克隆抗體（購自武漢博士德生物工程有限公司）；抗鼠IgG抗體（購自北京中杉金橋生物技術有限公司）；免疫組織化學試劑盒及DAB顯色試劑盒（購自武漢博士德生物工程有限公司）。

1.2.2 免疫組織化學檢測:①109例結直腸癌組織標本經4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，切片厚5 μm，經常規脫蠟水化，枸櫞酸緩沖液高溫修復抗原。以0.3%過氧化氫-甲醇孵育10 min，以阻斷清除內源性過氧化物酶。PBS漂洗4次滴加5% BSA封閉液，室溫孵育60 min，傾去。滴加一抗1:50鼠抗人CD4+、CD8+單克隆抗體，4 ℃冰箱孵育過夜，PBS漂洗后。再滴加二抗抗鼠IgG抗體，室溫孵育20 min，PBS漂洗。DAB顯色15 min，蘇木素復染，脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，PBS代替一抗作陰性對照。②結果判讀:通過光學顯微鏡（德國Olympus公司）分析特定免疫細胞染色浸潤的程度。CD4+、CD8+T淋巴細胞的量化標準:腫瘤組織中上皮細胞浸潤＞5%為高表達，浸潤≤5%為低表達，CD4+/CD8+為兩者同時高表達。

1.3 隨訪計劃 采用門診或電話對所有患者進行為期5年的隨訪，截止時間為2019年1月。隨訪研究的主要終點是無病生存率（disease-free survival，DFS），定義為從手術之日起至第1次出現局部或者區域復發轉移、隨訪終止或死亡時間；總生存率（overall survival，OS），定義為手術之日至出現任何原因引起的死亡時間或隨訪終止。

1.4 統計學處理方法 采用SPSS17.0軟件進行統計學分析。應用Pearson χ2檢驗或Fisher精確概率法對2組患者之間臨床病理特征進行比較。采用Kaplan-Meier分析方法繪制生存曲線，Log-rank檢驗比較分組生存率的差異。運用Cox回歸模型進行單因素及多因素預后分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 腫瘤浸潤CD4+、CD8+T淋巴細胞水平及分組免疫組織化學結果顯示，CD8+T淋巴細胞浸潤高水平78例，低水平31例；CD4+T淋巴細胞浸潤高水平56例，低水平53例，見圖1。

2.2 腫瘤浸潤CD4+、CD8+T淋巴細胞水平與結直腸癌患者臨床病理特征的關系 結直腸癌組織中CD4+、CD8+T淋巴細胞水平與腫瘤分期、浸潤深度密切相關（P＜0.05）；而與年齡、性別、腫瘤位置及大小等無關（P＞0.05）。同時，淋巴結轉移與腫瘤浸潤CD8+T淋巴細胞密切相關（P＜0.05），而與腫瘤浸潤CD4+T淋巴細胞無關（P＞0.05）。見表1。

2.3 腫瘤浸潤CD4+、CD8+T淋巴細胞水平與結直腸癌患者的生存預后分析 109例結直腸癌患者隨訪，其中失訪10 例（其中包括非腫瘤相關死亡病例）。生存曲線分析顯示，高水平CD8+及CD8+/CD4+結直腸癌患者的DFS和OS較好（P＜0.05）。而CD4+T細胞浸潤結直腸癌患者的DFS、OS與低水平組差異無統計學意義（P＞0.05），見圖2。

圖1 免疫組織化學檢測腫瘤浸潤CD4+、CD8+ T淋巴細胞水平（×200）

表1 腫瘤浸潤CD4+、CD8+ T淋巴細胞水平與結直腸癌患者臨床病理特征的關系

2.4 影響結直腸癌患者預后的Cox單因素及多因素分析 單因素Cox回歸分析結果顯示，結直腸癌患者預后DFS和OS與腫瘤分期、分化程度、浸潤深度、淋巴結轉移、CD4+、CD8+及CD8+/CD4+密切相關（P＜0.05），而與年齡、性別、腫瘤位置、腫瘤大小無關（P＞0.05）。將上述預后相關因素進行多因素Cox回歸分析，顯示腫瘤分期、淋巴結轉移、CD8+及CD8+/CD4+均為結直腸癌患者術后DFS和OS預后不良的獨立危險因素（P＜0.05），同時浸潤深度僅為DFS預后的獨立危險因素（P＜0.05），見表2。

3 討論

圖2 腫瘤浸潤CD4+、CD8+ T淋巴細胞水平與結直腸癌患者預后的生存曲線

表2 影響結直腸癌患者預后的Cox單因素及多因素分析

結直腸癌的發生、發展是一個多因素、多階段與多基因變異積累的、復雜的病理演變過程，涉及到腫瘤細胞與正常細胞的增殖和凋亡、機體對腫瘤細胞的免疫監視、腫瘤細胞的免疫逃逸等多個環節[7]。研究證實，T淋巴細胞介導的抗腫瘤免疫反應在機體有效清除腫瘤原發病灶、防止腫瘤轉移中起著重要作用。其中，腫瘤特異性CD4+和CD8+T淋巴細胞效應功能受損或呈耗竭時表現為促炎細胞因子的生成減少，對抗原的刺激反應性低[8]。因此，CD4+及CD8+可能成為惡性腫瘤的新生物標志物和判斷治療及預后的細胞靶點。

本研究通過對結直腸癌組織標本進行免疫組織化學分析，發現結直腸癌組織中CD4+及CD8+T淋巴細胞浸潤水平明顯高于癌旁組織。現在認為，腫瘤浸潤淋巴細胞在惡性腫瘤組織中的浸潤程度，以及淋巴細胞亞群的比例變化，影響預后生存[9]。已有研究表明，淋巴細胞的浸潤程度可能與結直腸癌形成等有一定的相關性[10]，與我們的研究結果一致。同時，進一步分析CD4+及CD8+腫瘤浸潤T淋巴細胞與臨床病理特征及預后的關系，提示CD4+及CD8+T淋巴細胞水平與腫瘤分期、浸潤深度密切相關（P＜0.05）。運用Kaplan-Meier及Log-Rank檢驗分析，高水平CD4+、CD8+及其CD4+/CD8+結直腸癌患者預后較好，與以往研究[11]相一致。進一步推測CD4+及CD8+腫瘤浸潤淋巴細胞變化可能改變腫瘤微環境免疫平衡，參與腫瘤的發生、發展，影響腫瘤預后。本研究還通過Cox回歸單因素及多因素分析亦發現，腫瘤分期、淋巴結轉移、CD8+及CD4+/CD8+均為結直腸癌患者術后DFS和OS預后不良的獨立危險因素（P＜0.05）。因此，腫瘤浸潤淋巴細胞可作為評價術后患者復發風險和總生存率的預測指標。

目前認為，T淋巴細胞是強有力的、對腫瘤細胞有直接殺傷作用的細胞，可抵抗腫瘤發生、轉移，承擔著腫瘤的免疫監視作用[12]。T淋巴細胞主要分為CD4+T亞群及CD8+T淋巴細胞亞群，其比例和功能等特征在一定程度上反映了機體抗腫瘤反應的總體水平。CD4+T細胞亞群主要包括Th1細胞亞群、Th2細胞亞群、Th17細胞亞群、調節性T細胞（Treg）等，各特異性亞群的功能不同，部分在宿主防御反應和免疫介導的疾病中起著決定性的作用[13]。研究發現Thl細胞亞群和幾乎所有類型的癌癥改善的臨床結果有強烈的關系[14]。另外，以表達CD4+/CD25+/FoxP3+為特征的Treg細胞能夠抑制T細胞的免疫功能并能干擾免疫療法的作用[15]。CD8+T細胞被認為是腫瘤微環境中浸潤的主要淋巴細胞亞群，表現為細胞毒性效應。一方面，它能夠通過分泌細胞毒性顆粒如穿孔素、顆粒酶和細胞表面受體如TNF相關的凋亡誘導配體（TRAIL）來殺傷腫瘤細胞，承擔免疫防御和免疫監視的功能[16]。另一方面，識別腫瘤細胞上的特異性抗原，且在Th細胞的幫助下活化，進一步殺傷腫瘤細胞[17]。因此，本研究中CD4+及CD8+T淋巴細胞浸潤可在一定程度上反映抗腫瘤免疫功能，可作為預測遠期生存的標志。

關于CD4+T淋巴細胞水平是否有利于癌癥患者預后的評估仍存在相當大的爭議。研究表明高CD4+T淋巴細胞浸潤的膀胱癌患者，其預后較差[18]。而另一研究表明，CD4+T淋巴細胞浸潤的程度和患者的預后呈明顯正相關[19]。本研究創新性采用CD4+聯合CD8+T淋巴細胞浸潤綜合比較分析預測結直腸癌患者預后，并作為評價DFS及OS獨立因素之一。目前，廣泛被接受的假說是癌癥患者的預后取決于浸潤的CD4+T淋巴細胞和CD8+T淋巴細胞的比值。CD4+/CD8+T淋巴細胞保持動態平衡，以維持機體細胞免疫功能的穩定。改變了組織局部免疫微環境，免疫抑制加重，免疫監視功能減弱，有利于腫瘤細胞增殖，從而有利于腫瘤的進展、侵襲或轉移[20]。本研究結論表明，CD4+、CD8+表達下降提示結直腸癌患者預后更差，在一定程度上與上述結論相符合。

綜上所述，CD4+及CD8+T淋巴細胞浸潤水平對結直腸癌患者預后的評估有重要指導價值，但其機制等仍有待進一步研究。此外，此研究對于尋找結直腸癌治療的免疫療法有很大的提示意義。