miR-144-5p、miR-668-3p、miR-134-5p在兒童原發性免疫性血小板減少癥中的表達

金速速，李帆帆，葉熳麗，舒曠怡，李姍姍，柳潔，江明華

（溫州醫科大學附屬第二醫院 醫學檢驗中心，浙江 溫州 325027）

兒童原發性免疫性血小板減少癥（immune thrombocytopenia，ITP）是兒童時期常見的一種免疫性出血性疾病，約占出血性疾病的三分之一。其發病機制迄今尚未闡明，目前認為主要是體液免疫和細胞免疫介導的血小板過度破壞以及巨核細胞生成不足和質量異常[1]。miRNA是一種高度保守、大小為20～25個核苷酸的非編碼小RNA[2]。近年來研究發現，miRNA對機體免疫細胞具有多種調控功能，在固有免疫和適應性免疫中發揮著重要作用，并參與自身免疫性疾病的發病與發展。目前，ITP的診斷無特異性指標，主要根據病史、體格檢查、血小板計數、血涂片及骨髓穿刺分析來診斷[3]，屬于臨床排除性診斷。因此，本研究利用RT-qPCR對急、慢性ITP患兒的miR-144-5p、miR-668-3p、miR-134-5p進行檢測，分析miRNAs與血小板相關指標的關系及意義，探討miRNAs在兒童ITP的發生發展中的作用。

1 對象和方法

1.1 對象及診斷標準 選取2016年1月至2018年1 月于溫州醫科大學附屬第二醫院確診的ITP患兒25例。其中急性ITP患兒15例，慢性ITP患兒10例；男14例，女11例；年齡1～16歲。所有診斷均符合《血液病診斷及療效標準》[4]。入選者需符合:①至少2次血常規檢查示血小板計數減少，血細胞形態無異常；②脾臟一般不增大；③骨髓檢查:巨核細胞增多或正常，伴成熟障礙；④須排除其他繼發性血小板減少癥。另選取15 例同期體檢的健康兒童作為對照組，排除血小板數量異常及功能異常等疾病，2組對象在年齡和性別構成上差異無統計學意義。本研究經本院倫理委員會批準，所有受檢者的監護人均知情同意。

1.2 儀器與試劑 TRIzol Reagent（美國Invitrogen Life Technologies公司）；miDETECT A TrackTMmiRNA qPCR Kit、miDETECT A TrackTMmiRNA Forward Primer及miDETECT A TrackTMU6 Forward Primer（廣州銳博生物科技有限公司）；淋巴分離液（美國Sigma公司）；實時熒光定量PCR儀（美國Applied Biosystems公司）；nanodrop 2000c（美國Thermo Fisher Scientific公司）；Sysmex XE5000全自動血細胞分析儀及原裝配套試劑（日本Sysmex公司）。

1.3 方法

1.3.1 血標本的采集及處理:采集ITP患兒和對照組靜脈血2 mL于EDTA抗凝管中，400×g離心10 min并分離血漿。將分離的細胞沿管壁緩慢加于淋巴分離液上，2 000 r/min離心20 min后小心吸取白色云霧層細胞至另一試管中。PBS洗滌2次后加TRIzol于-80 ℃凍存。

1.3.2 總RNA的提取:利用TRIzol法提取總RNA，NanoDrop檢測RNA的濃度及純度，OD260/280在1.8～2.0者符合RT-qPCR檢測要求。

1.3.3 RT-qPCR檢測:選取miRNA芯片檢測中有差異表達（Fold change≥1.5，且P ＜0.05）的3 個miRNA（miR-668-3p、miR-134-5p、miR-144-5p）進行qPCR分析驗證。將提取的總RNA 1 μg、5×Poly（A）Polymerase Buffer 2 μL、Poly（A）Polymerase 1 μL、RNase-free water 6 μL于冰上配制，37 ℃反應1 h，反應完成后置于冰上備用。反轉錄反應:反應體系為RTase mix 4 μL、5×RTase Buffer 4 μL、miDETECT A TrackTMUni-RT Primer 2 μL、Poly（A）Tailing產物10 μL，以上體系均在冰上配制；擴增條件為42 ℃ 1 h，72 ℃ 10 min，反應完成后所得cDNA置于冰上備用。qPCR反應:反應體系為miDETECT A TrackTMUni-Reverse Primer 0.5 μL、miDETECT A TrackTMmiRNA Forward Primer 0.5 μL、2×SYBR Green Mix 10 μL、cDNA 2 μL、RNase-free water加至20 μL；擴增條件為95 ℃ 10 min；95 ℃ 2 s，60 ℃ 20 s，70 ℃10 s，40 cycles，熒光信號采集設在70 ℃。每個標本設置3個復孔，PCR反應以U6為內參，將miR-668-3p、miR-134-5p、miR-144-5p的Ct值減去U6 Ct值作為△Ct實驗值，△△Ct=△Ct實驗-△Ct對照。以2-△△Ct法計算miRNA的相對表達量。

1.3.4 血小板計數及未成熟血小板分數（immature platelet fraction，IPF%）檢測:ITP患兒及IPF%對照組的血小板計數及在Sysmex XE-5000上完成檢驗。

1.4 統計學處理方法 采用SPSS22.0 軟件進行統計分析。計量資料以形式表示，采用Kolmogorov-Smirnov檢驗法進行正態性檢驗，符合正態分布的組間比較采用t 檢驗，相關性分析采用Spearman分析，診斷試驗采用ROC曲線并計算AUC。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 miRNAs在急、慢性ITP中的表達 選取miR-668-3p、miR-134-5p、miR-144-5p 3種miRNA，并利用RT-qPCR進行檢測。其中ITP組PBMCs中的miR-144-5p和miR-668-3p較對照組表達均上調，miR-134-5p表達下調，差異均有統計學意義（P＜0.05），且急性ITP組PBMCs中的miR-144-5p、miR-668-3p表達量要高于慢性ITP組，差異有統計學意義（P＜0.05），見圖1。

2.2 miRNAs表達水平與血小板計數的關系 miR-144-5p（r=-0.802，P＜0.001）和miR-668-3p（r=-0.753，P ＜0.001）的相對表達量與外周血血小板計數呈負相關，差異有統計學意義。而miR-134-5p與外周血血小板計數無相關性（r=-0.288，P=0.161）。見圖2。

圖1 miRNAs在急慢性ITP組和對照組PBMCs中的表達

圖2 miRNAs相對表達量與外周血血小板計數的相關性分析（n=25）

2.3 miRNAs診斷ITP的ROC曲線 以對照組的miRNAs表達量為對照，繪制miR-144-5p、miR-668-3p、miR-134-5p在急、慢性ITP診斷中的ROC曲線。miR-144-5p（AUC=0.930，P=0.001）對急性ITP的診斷價值要優于miR-668-3p和miR-134-5p，而miR-134-5p（AUC=0.895，P=0.003）對慢性ITP的診斷價值要優于miR-144-5p和miR-668-3p。基于約登指數，miR-144-5p和miR-134-5p的臨界值分別0.287、0.085，此時靈敏度分別為92%和90%，特異度為90%和80%。見圖3。同時，以慢性ITP的miRNAs表達量為對照，得到急性ITP miRNAs的ROC曲線，結果差異無統計學意義（均P＞0.05）。

圖3 miRNAs診斷急、慢性ITP的ROC曲線

2.4 miRNA聯合IPF診斷ITP的ROC曲線 為了進一步提高ITP的診斷水平，將miR-144-5p和miR-134-5p分別聯合IPF%構建logistic回歸模型，并利用預測概率生成ROC曲線。miR-144-5p聯合IPF%對急性ITP的預測價值要優于單個miR-144-5p指標，當閾值取0.562時預測的靈敏度為達93.3%，特異度可達100%。同樣的，miR-134-5p聯合IPF%對慢性ITP的預測價值也要優于單個miR-134-5p指標，閾值取1.934時靈敏度和特異度分別是90.0%和93.3%為最佳。見圖4。

圖4 miRNAs及miRNA聯合IPF%診斷ITP的ROC曲線

3 討論

miRNA作為一類小的調控RNA，已被證明在免疫性疾病中發揮重要的作用。miR-144可通過靶向調控成纖維細胞樣滑膜細胞中Cadherin-11的表達，調控骨髓間充質干細胞的成骨分化，參與類風濕性關節炎的病理生理過程[5]。此外，miR-144可通過抑制RANKL mRNA的翻譯，抑制成熟免疫細胞中細胞因子的表達，提示miR-144參與免疫性疾病的發生與發展[6]。本研究發現，ITP組的miR-144-5p表達水平較對照組高，并隨著病程的發展呈下降趨勢，且與血小板計數呈負相關。miR-144可通過靶向調控meis1表達，meis1是同源基因HoxA9的輔助因子[7]，而HoxA9是造血細胞正常分化所必需的基因，不僅影響了造血干細胞的數量，還參與造血干細胞向巨核系的分化[8]，進而影響血小板的生成，提示miR-144-5P在ITP的發病和疾病進展中發揮了作用。而值得注意的是，ZUO等[9]研究中發現成人ITP患者血漿中miR-144的表達水平較正常人低，與本研究結果相反，其原因可能是成人ITP和兒童ITP的發病機制不同，或是血漿和PBMC中的miRNA參與調控的機制不同。

以往對miR-668的研究主要集中在腫瘤、炎癥及神經系統性疾病等方面。本研究發現miR-668-3p在ITP患兒組中的表達要高于對照組，且急性ITP組高于慢性ITP組（P ＜0.05）。一項靶基因預測研究結果表明，miR-668-3p的靶基因為HoxB4[10]。而miR-668可通過調控HoxB4基因來介導TPO受體、Scl-1、Cyclin D1、Fog-1等的表達，從而影響巨核細胞的成熟及血小板的生成[11]。據此推斷，miR-668-3p可能參與了ITP的發病過程，且與疾病的發展存在著關聯。

ZHANG等[12]研究發現miR-134在川崎病中可表現出抗炎作用，導致CREB5、IL8RA、PPP1R3B、ACSL1和LRRK2表達上調，且經過靜脈免疫球蛋白治療后呈上調趨勢。在急性缺血性腦卒中，miR-134與血清IL-6和血漿高敏感性CRP表達呈強正相關[13]，由此可知miR-134參與炎癥反應的調控。本研究結果顯示miR-134 在ITP組中的表達要低于對照組，而ITP患者存在促炎癥細胞因子與抗炎細胞因子分泌失衡[14]，會激活自身反應效應因子B和T淋巴細胞，進而啟動血小板破壞，而血小板破壞是由細胞毒性T淋巴細胞介導，并由輔助性T細胞（Th1/Th17）釋放促炎細胞因子（IL-2/IL-17）[15]，提示miR-134可能通過炎癥反應來介導血小板的破壞。此外，miR-134在A549和Calu-3細胞中過表達可促進細胞增殖，抑制細胞凋亡和遷移能力[16]，miR-134可能通過細胞凋亡來介導免疫調節。

本研究發現，相較于miR-134-5p和miR-668-3p，miR-144-5p對急性ITP的診斷價值較高，而miR-134-5p對慢性ITP的診斷價值較高。IPF是骨髓巨核細胞最先釋放入血的血小板，不僅體現了骨髓巨核細胞的血小板生成狀態，也能反映骨髓的血小板生成能力。研究表明[17]IPF是一種快速、廉價的血小板減少癥病因學標志物，可作為評價骨髓血小板生成狀態的參數，也被認為是慢性ITP發展的一個潛在的預后指標。本研究發現miR-144-5p聯合IPF%在診斷急性ITP中的靈敏度提高到93.3%，對高危人群的篩檢具有較大的意義；其特異度也提高到100%，對ITP的確診具有相當大的價值，特別是對臨床上有些不愿意做有創檢查如骨髓穿刺檢查的患者診斷更有價值。同樣的，miR-134-5p聯合IPF%對慢性ITP的預測價值也要優于單個miR-134-5p指標，靈敏度和特異度分別可達90.0%和93.3%。

綜上所述，ITP患兒PBMCs中miR-668-3p、miR-134-5p及miR-144-5P的表達量與對照組之間存在差異，且與初發時的血小板計數存在著相關性。說明這些miRNAs參與了ITP的發生與發展，在整個疾病中參與了免疫調節等作用，但具體機制有待進一步研究。通過ROC曲線分析，也得出miR-144-5P及miR-134-5p聯合IPF%對于ITP有較高診斷價值。這些指標較易獲得，可以減少患兒骨髓穿刺的應用，能將ITP檢查的不適度減至最輕，可為ITP提供輔助診斷。