miR-148b參與調控彌漫性大B細胞淋巴瘤藥物敏感性的機制

林曉驥，方瑋玥，董玉青，孫妮，蘇童，楊向綢，郭文堅，何牧卿，姚榮欣

（溫州醫科大學附屬第二醫院育英兒童醫院 血液腫瘤科，浙江 溫州 325027）

彌漫性大B細胞淋巴瘤（diffuse large B-cell lymphoma，DLBCL）是非霍奇金淋巴瘤（non-Hodgkin’s lymphoma，NHL）中最常見的類型，占成人NHL的30%～40%[1-2]。環磷酰胺（cyclophosphamide，CTX）、阿霉素（adriamycin，ADM）、長春新堿（vincristine VCR）與強的松（prednisolone，Pred）組成的CHOP方案是目前被證實的治療DLBCL的最經典治療方案，然而超過50%患者出現耐藥或復發的現象[3]。眾所周知，DLBCL難治的主要原因是腫瘤細胞產生了多藥耐藥，故研究DLBCL耐藥機制是提高DLBCL患者療效的關鍵。

miR-148b位于人染色體12q13.13上，目前研究證實miR-148b與腫瘤細胞的耐藥性關系密切。SUI等[4]研究發現上調miR-148b可以逆轉非小細胞肺癌細胞株對順鉑的耐藥性。WU等[5]也證實，miR-148b上調同樣可以增加人Burkitt淋巴瘤Raji細胞株對放療的敏感性。然而，miR-148b在DLBCL藥物敏感性中的作用還沒有相關報道。有學者將DLBCL分為2類，一類是對CHOP方案具有較低敏感性，另一類是對CHOP方案具有較高敏感性。LIU等[6]對兩類DLBCL中蛋白進行2D電泳聯合質譜分析發現Ezrin蛋白在低敏感組中表達水平明顯高于高敏感組，表明Ezrin與DLBCL的耐藥性存在關聯。我們采用生物信息學軟件（RAID v2.0）預測分析發現，Ezrin是miR-148b的靶基因之一。所以，本研究探討miR-148b是否調控Ezrin繼而影響DLBCL細胞對藥物的敏感性，從而探究miR-148b/Ezrin軸成為DLBCL治療的靶向分子的潛能。

1 材料和方法

1.1 實驗材料和試劑 人DLBCL細胞株CRL2631購自中國科學院上海細胞庫，CTX、ADM、VCR和Pred購自美國Sigma公司，miR-148b mimic、miR-148b inhibitor以及陰性對照物由廣州銳博生物科技有限公司構建合成，SYBR green和實時熒光定量PCR試劑盒購自美國Applied Biosystems公司，LipofectamineTM2000轉染試劑購自美國Invitrogen公司，CCK-8試劑盒購自日本同仁公司，Ezrin單抗購自美國Cell Signaling Technology公司，β-actin單抗和MDR-1 單抗購自美國Santa Cruz Biotechnology公司。

1.2 方法

1.2.1 誘導培養耐藥細胞株CRL2631/CHOP:根據參考文獻[7]，用CHOP方案四藥聯合（CTX、ADM、VCR和Pred的比率為80:5:0.16:11.1）把DLBCL細胞系CRL2631誘導產生穩定的耐藥株CRL2631/CHOP，細胞在誘導耐藥的初期極易死亡，選擇5 ng/mL的低濃度CHOP作為誘導起始濃度，逐漸提高CHOP濃度（10、20、40、80、160、320、640、1 280 ng/mL），最終獲得能夠在CHOP濃度為640 ng/mL的培養液中持續存活5 d并穩定增殖的耐藥細胞株。

1.2.2 細胞轉染:取對數生長期的細胞接種于24孔板（2×104細胞/孔），使細胞匯合達到70%～80%，采用LipofectamineTM2000轉染試劑介導轉染。將CRL2631分別轉染miR-148b inhibitor和陰性對照物，CRL2631/CHOP細胞分別轉染miR-148b mimic和陰性對照物，見表1。轉染后放入培養箱培養8 h，更換雙倍血清的培養基，繼續培養48 h，收集細胞。

表1 miR-148b mimic、miR-148b inhibitor和陰性對照物的序列

1.2.3 CCK-8 檢測細胞活力:取對數生長期的細胞接種于96孔板中，每孔加入2×103個細胞，每次實驗設3個復孔，與不同CHOP濃度（40、80、160和320 ng/mL）共同孵育72 h。每孔加入新鮮配制的含10 μL的毒性檢測液CCK-8溶液，在細胞培養箱內繼續孵育4 h，分別用酶標儀在450 nm測定吸光度（OD值）。實驗重復3次。取實驗結果的平均值作為最終實驗結果。按公式計算生長抑制率=[（對照組OD-實驗組OD）]/對照組OD×100%，以濃度為橫坐標，生長抑制率為縱坐標。

1.2.4 雙熒光素酶實驗:根據參考文獻[8]，將含miR-148b作用靶點的Ezrin 3’UTR和作用靶點突變的mutant-Ezrin-3’UTR連接到熒光素酶報告載體上，分別命名為野生型Ezrin-3’UTR（WT）和突變型Ezrin-3’UTR（Mut）報告質粒（此項工作由南京金斯瑞生物科技公司完成）。將構建的載體分別與miR-148b mimic和miR-148b inhibitor共轉染至CRL2631細胞。按照雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒說明書，分別檢測各組細胞螢火蟲熒光素酶和海腎熒光素酶活信號，計算相對熒光值=熒光素酶活性值/海腎熒光素酶活性值。

1.2.5 實時熒光定量PCR:TRIzol試劑提取細胞總RNA，紫外分光光度計對提取的RNA進行濃度檢測，反轉錄成cDNA，加入特異引物、SYBR Premix ExTaq和PCR所需試劑，于實時定量PCR儀（ABI 7500）上進行反應，制作熔解曲線判斷引物特異性，分別以U6為內參基因，采用2-ΔΔCT方法計算基因的相對表達量。各基因的引物序列如下:①miR-148b上游引物:5’-GCGGACACGGAGCCAGAACA-3’；miR-148b下游引物:5’-ATCACGGTCGAGGCTCAGGG-3’；②U6上游引物:5’-GCCGTTGCAGCACATATACAATAAT-3’；U6下游引物:5’-CGCTACGTTAATGCTCGTGTCAT-3’。反應條件:95 ℃1 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，共40個循環；終延伸68 ℃ 40 s。

1.2.6 Western blot:使用RIPA裂解液提取腫瘤組織細胞或細胞株的總蛋白，BCA蛋白定量試劑盒檢測總蛋白含量。將等量蛋白樣本以十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺（SDS-PAGE）凝膠電泳進行分離，分離后的蛋白轉移至PVDF膜，經PBST清洗后，使用含5%脫脂奶粉PBST溶液室溫封閉2 h，將膜與稀釋到一定濃度的對應一抗在4 ℃下孵育過夜，第2天將膜再與二抗室溫孵育2 h，使用ECL化學發光顯色液對條帶進行顯色，其中以β-actin作為對照蛋白。

1.3 統計學處理方法 采用SPSS18.0軟件進行統計分析，每次試驗重復3次，數據以表示；2組間比較采用兩獨立樣本t檢驗，2組間不同時間比較采用重復測量資料的方差分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 誘導培養耐藥細胞株CRL2631/CHOP 采用CCK-8方法檢測CRL2631和CRL2631/CHOP細胞對不同濃度CHOP（40、80、160和320 ng/mL）的敏感性影響。結果顯示，在CHOP濃度為80 ng/mL開始，CRL2631/CHOP細胞在不同濃度的CHOP下細胞存活率均較CRL2631細胞顯著升高（P＜0.05），表明CRL2631/CHOP細胞較CRL2631細胞的藥物敏感性下降。Western blot檢測結果顯示在CRL2631/CHOP細胞中MDR-1蛋白表達水平也顯著高于CRL2631細胞，其蛋白相對表達量分別為（1.34±0.14）和（0.35±0.08）（P＜0.001）。見圖1。

2.2 miR-148b和Ezrin在CRL2631和CRL2631/CHOP細胞株中的表達情況 實時熒光定量PCR法檢測比較CRL2631和CRL2631/CHOP細胞的miR-148b mRNA表達水平，結果顯示CRL2631/CHOP細胞的miR-148b mRNA表達水平顯著低于CRL2631細胞（P=0.001）。Western blot結果顯示，CRL2631/CHOP細胞的Ezrin蛋白表達水平顯著高于CRL2631細胞，其蛋白相對表達量分別為（1.14±0.18）和（0.45±0.06）（P＜0.05），見圖2。

圖1 CRL2631/CHOP細胞與CRL2631細胞的藥物敏感性和MDR-1表達的情況

圖2 miR-148b和Ezrin在CRL2631和CRL2631/CHOP細胞中的表達情況

2.3 Ezrin是miR-148b靶基因的預測及驗證 通過生物信息學軟件（RAID v2.0）預測分析發現，Ezrin 3’UTR存在潛在的miR-148b結合位點（見圖3），我們推測Ezrin是miR-148b的直接靶基因。為了驗證這一推測，我們采用經典的雙熒光素酶報告基因實驗。結果顯示相對于陰性對照組，上調miR-148b的表達后，miR-148b mimic+野生型Ezrin 3’UTR載體（WT）組熒光素酶活性明顯降低（P＜0.05），而miR-148b mimic+突變型Ezrin 3’UTR載體（MUT）組熒光素酶活性無明顯改變。相反，在miR-148b inhibitor+WT組，下調miR-148b的表達后，熒光素酶活性較陰性對照組顯著提升（P＜0.05），而miR-148b inhibitor+MUT組的熒光素酶活性改變與陰性對照組比較，差異無統計學意義（P＞0.05），見圖4。

圖3 Ezrin 3’ UTR與miR-148b的結合位點及其點突變

圖4 野生型/突變型Ezrin 3’ UTR載體和miR-148b mimic/inhibitor共轉染CRL2631細胞的熒光素酶活性情況

2.4 下調miR-148b的表達對CRL2631細胞Ezrin蛋白和CHOP敏感性的影響 我們分別將miR-148b inhibitor和陰性對照物轉染至CRL2631細胞。CCK-8實驗結果顯示，miR-148b inhibitor組CRL2631細胞對在不同濃度CHOP下細胞存活率均較陰性對照組顯著上升（P＜0.05），表明下調miR-148b的表達使CRL2631細胞的藥物敏感性下降。Western blot結果表明，miR-148b inhibitor組MDR-1和Ezrin的表達較陰性對照組顯著上升，其MDR-1相對表達量分別為（1.45±0.23）和（0.31±0.09）（P＜0.001），Ezrin相對表達量分別為（1.53±0.14）和（1.01±0.11）（P＜0.05），見圖5。

圖5 下調miR-148b對CRL2631細胞的藥物敏感性、Ezrin和MDR-1蛋白表達的影響

2.5 上調miR-148b的表達對CRL2631/CHOP細胞Ezrin蛋白和CHOP敏感性的影響 我們分別將miR-148b mimic和陰性對照物轉染至CRL2631/CHOP細胞。CCK-8 實驗結果顯示，miR-148b mimic組CRL2631/CHOP細胞對不同濃度CHOP下細胞存活率較陰性對照組顯著下降（P＜0.05），表明上調miR-148b的表達使CRL2631/CHOP細胞的藥物敏感性上升。Western blot結果表明，miR-148b mimic組MDR-1和Ezrin的表達較陰性對照組顯著下降，其MDR-1相對表達量分別為（0.47±0.12）和（1.52±0.24）（P ＜0.001），而Ezrin相對表達量分別為（0.62±0.16）和（1.51±0.25）（P＜0.001），見圖6。

圖6 上調miR-148b對CRL2631/CHOP細胞的藥物敏感性、Ezrin和MDR-1蛋白表達的影響

3 討論

DLBCL是為一組異質性很強的B細胞性淋巴瘤，病理上以彌漫性分布的惡性大B淋巴細胞為特征，臨床上表現為侵襲性的病程[9]。隨著利妥昔單抗的引入，R-CHOP化療方案大大改善了DLBCL患者的預后，但仍有相當一部分患者出現無效或復發的現象。眾所周知，DLBCL難治的原因主要是腫瘤細胞對化療藥物產生了耐藥，尤其產生的多藥耐藥是治療DLBCL的主要障礙。因此，研究DLBCL耐藥機制是提高DLBCL患者療效的關鍵。

miRNAs是一類長度為二十幾個核苷酸的內源性非編碼調控RNA，參與細胞發育、增殖、分化、凋亡等一系列重要生物學過程。有研究表明，miRNAs與DLBCL耐藥性存在關系密切。BAI等[10]研究發現，miR-21在參與調控DLBCL細胞株CRL2631對CHOP的敏感性，敲除miR-21可顯著靶向下調PTEN蛋白表達水平并且通過影響PI3K/AKT信號通路提高DLBCL細胞株對CHOP方案化療的敏感性。KIM等[11]也發現穩定表達miR-124可以靶向下調PDE4B蛋白，并改善DLBCL細胞對糖皮質激素的耐藥性。MARQUES等[12]證實在15 例DLBCL細胞株中對蒽環類藥物敏感性的細胞株均存在miR-34a高表達，而miR-34a可以靶向下調FOXP1從而增加DLBCL細胞對蒽環類藥物的敏感性。YUAN等[13]從56例DLBCL患者和20例健康對照組的血清中應用RT-PCR分析，在對R-CHOP化療方案耐藥的DLBCL患者中存在血清miR-125b和miR-130a存在更高的表達，進一步研究發現，miR-125b和miR-130a的動態變化可以用作監測DLBCL患者的復發、進展或耐藥的一個有效指標。LEIVONEN等[14]發現在復發DLBCL患者中普遍存在miR-370-3p、miR-381-3p和miR-409-3p的低表達；進一步研究結果顯示在人DLBCL細胞株SU-DHL-4細胞中上調miR-370-3p、miR-381-3p和miR-409-3p均可以增加細胞對利妥昔和蒽環類藥物的敏感性。而本研究發現耐藥株CRL2631/CHOP的miR-148b的表達量明顯低于CRL2631細胞。由此可見，miR-148b可能在與DLBCL產生CHOP耐藥的過程中發揮調控作用。

miR-148b位于人染色體12q13.13上，目前研究證實miR-148b在結腸癌、胃癌、乳腺癌、肺癌和黑色素瘤等多種腫瘤組織中普遍存在表達異常[15-17]。甚至多個研究表明，miR-148b與腫瘤細胞的耐藥性也存在關系密切。WANG等[18]發現miR-148b的表達量在放療耐藥的非小細胞肺癌患者中較放療敏感的患者顯著減少。而SUI等[4]研究結果證實miR-148b的過表達可以負向調控靶基因DNMT1，從而逆轉非小細胞肺癌細胞株A549/DDP和SPC-A1/DDP對順鉑的耐藥性。HUMMEL等[19]發現miR-148a的上調可以增加食管腺癌和鱗狀細胞癌細胞株對順鉑和5-氟尿嘧啶的敏感性。WU等[5]也證實，MiR-148b上調同樣可以增加人Burkitt淋巴瘤Raji細胞株對放療的敏感性。然而，miR-148b在DLBCL耐藥中的作用還沒有相關報道。因此本研究重點研究miR-148b在DLBCL產生耐藥性過程中所發揮的作用及機制。我們采用了miRNA模擬/干擾技術和CCK-8方法研究DLBCL的CRL2631和CRL2631/CHOP細胞株進行對CHOP的藥物敏感性試驗。在我們的研究結果中，上調miR-148b的表達可以增加CRL2631/CHOP細胞對CHOP的敏感性，而下調miR-148b表達增加了CRL2631細胞的耐藥性。因此我們的研究進一步證明了DLBCL對CHOP的耐藥性與miR-148b的異常表達密切相關。

目前研究證實，miRNAs通過堿基互補配對原則特異性的與相關靶基因mRNA 3’UTR的啟動序列相結合從而發揮腫瘤的增殖、轉移和浸潤等多種生物學功能。因此，本研究旨在探究miR-148b在參與調控DLBCL耐藥性的靶基因。我們通過microrna.org網上預測發現Ezrin是miR-148b的靶基因之一。Ezrin蛋白是ERM（Ezrin、Radixin、Moesin）蛋白家族成員之一，作為酪氨酸激酶的底物，Ezrin蛋白能在細胞膜蛋白與肌動蛋白骨架之間起到橋梁的作用，參與細胞形態的形成、黏附、運動以及細胞的增殖和生存等功能。目前研究表明Ezrin蛋白與許多腫瘤的發生、侵襲和轉移有密切關系，如前列腺癌、乳腺癌、胰腺癌和結腸癌等[20-21]。甚至有研究結果顯示，Ezrin基因還參與調控腫瘤的耐藥性。LV等[22]報道，Ezrin參與了一種蛋白質復合物EBP50組成，該復合物賦予胃癌細胞具有對5-氟尿嘧啶的化學敏感性。此外，在非小細胞肺癌中，Ezrin與EGFR的相互作用增強了EGFR致癌功能，增加非小細胞肺癌對埃羅替尼的耐藥性[23]。CHEN等[24]發現沉默Ezrin使人類肺癌細胞株95D細胞增加對抗腫瘤藥物的敏感性。PORE等[25]發現抑制Ezrin表達后能減少DLBCL細胞株OCI-LY-10、OCI-LY-3和SU-DHL-6細胞的增殖和生長，同時在動物實驗中也進一步證明Ezrin抑制劑的使用顯著減少DLBCL皮下移植瘤的生長。根據化療的敏感性DLBCL被分為2類:一類是對CHOP方案具有較低敏感性，另一類是對CHOP方案具有較高敏感性。LIU等[6]對兩類DLBCL中蛋白進行2D電泳聯合質譜分析發現，有19個蛋白在兩類DLBCL中表達有2倍差異。其中Ezrin蛋白在CHOP高敏感性的DLBCL組中表達水平明顯低于CHOP低敏感的DLBCL組。MAXWELL等[26]研究發現在CHOP耐藥的DLBCL細胞株中存在Ezrin蛋白的高表達。由此表明Ezrin與DLBCL的耐藥性可能存在密切關聯。我們通過Western blot檢測顯示耐藥株CRL2631/CHOP細胞Ezrin的表達量明顯高于CRL2631細胞。這些實驗結果也進一步揭示Ezrin與DLBCL的耐藥性密切相關。

為了證明miR-148b和Ezrin兩者在DLBCL中存在實質性聯系，我們采用經典的雙熒光素酶報告基因實驗，將Ezrin 3’UTR熒光素酶報告載體和miR-148b inhibitor/miR-148b mimic共轉染CRL2631細胞。我們的結果發現miR-148b mimic與野生型Ezrin 3’UTR載體共轉染后細胞的熒光素酶活性明顯降低，而miR-148b inhibitor與野生型Ezrin 3’UTR載體共轉染后細胞的熒光素酶活性顯著提升。進一步Western blot結果顯示，在CRL2631細胞中miR-148b能調控Ezrin蛋白的表達，miR-148b的過表達可以下調Ezrin的表達，而下調miR-148b可以增加Ezrin蛋白的表達。由此證明Ezrin是miR-148b的直接靶基因。我們還發現，上調miR-148b的表達不僅增加CRL2631/CHOP細胞的藥物敏感性，還下調了Ezrin蛋白的表達。另外，下調miR-148b的表達使CRL2631細胞對CHOP敏感性的同時上調了Ezrin蛋白的表達。因此，我們的研究結果證實，miR-148b通過調控Ezrin調節DLBCL對CHOP的耐藥性。

綜上所述，我們的研究顯示miR-148b在耐藥性DLBCL細胞株中呈現相對低表達，上調miR-148b可顯著下調Ezrin蛋白表達水平而提高DLBCL細胞株對CHOP方案化療的敏感性。這些有助于我們探索DLBCL細胞耐藥性中的關鍵作用的分子及其調控機制，而miR-148b和Ezrin有望成為DLBCL患者靶向治療的新靶點。